[发明专利]开花作物授粉后柱头花粉数量的检测方法

权利要求书

1.开花作物花期授粉后柱头花粉数量的检测方法，其特征在于，包括柱头染色、分离并收集花粉、载玻片的制作、扫描载玻片、利用计数软件统计花粉粒数量及显微镜下计数的步骤。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）柱头染色：采集开花作物花期授粉后的柱头置于离心管中，向离心管中加入孔雀石绿染色液进行染色，收集染色液作为溶液I；

2）分离并收集花粉：将柱头转移至另一盛有孔雀石绿染色液的平底试管中，利用超声波细胞破碎仪破碎柱头组织，实现花粉粒与柱头的分离，收集染色液作为溶液II，用0.85%-1.15%NaCl溶液冲洗细胞破碎仪变幅杆上附着的花粉粒，收集冲洗液作为溶液III；合并溶液I、II和III，用真空抽滤瓶将上述合并液中的花粉粒收集在滤膜上；

3）载玻片的制作及扫描：将花粉粒收集在滤膜上后，将滤膜载有花粉粒面朝上，平展贴服于滴有15%-40%甘油溶液的载玻片上，制作成临时装片，用扫描仪将载玻片上的滤膜扫描为电子照片；

4）采用Image J软件统计滤膜上花粉粒数量，并将步骤2）中残余的柱头组织置于载玻片上，在显微镜下计数残留的花粉粒数量，滤膜上花粉粒数量与柱头残留的花粉粒数量之和，即为开花作物花期授粉后柱头花粉数量。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述孔雀石绿染色液是由0.1%孔雀石绿溶液与0.85%-1.15%NaCl溶液按1:400的体积比混合配制而成。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤1）中染色时间为15h，染色温度为37℃，以200rpm转速进行摇床震荡染色。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤2）中利用超声波细胞破碎仪破碎柱头组织所设定的程序如下：全程超声时间60s，超声时间60s，间歇时间0s，温度保护设定为50℃，超声功率100W，变幅杆规格为Φ6。

6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤3）中收集花粉所用真空抽滤瓶的过滤杯容积为300mL，集液瓶容积为2000mL，主体材质为硼砂玻璃，砂芯过滤基座材质为磨砂玻璃，过滤砂芯直径为20mm；滤膜材质为尼龙，滤膜孔径为10-30μm，滤膜形状为20mm＜直径＜25mm的圆形，或20mm＜边长＜25mm的正方形；使用时，将合并液倒入过滤杯中，经真空抽滤，花粉粒吸附于滤膜上，残余液体流经滤膜和过滤砂芯，收集于集液瓶中。

7.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，所述开花作物为桃。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤4）中采用Image J软件统计滤膜上花粉粒数量时，目标颗粒色彩参数设定范围为：色彩值120-150，饱和度70-255，亮度0-255，目标颗粒大小设定值为40-80，圆形轮廓设定值为0.5-0.8。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤3）中滤膜孔径为20μm。

10.根据权利要求1-6任一项所述的检测方法，其特征在于，开花作物花期授粉方式为昆虫传粉。