[发明专利]分离和扩增血液间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种分离和扩增血液间充质干细胞的方法。

背景技术

干细胞是指生物体内能够进行自我更新，并维持机体各组织细胞新陈代谢的一群细胞。同时，在生物体内各种组织受到内源或外源性的损害时，干细胞可以被激活执行分化功能，从而达到修复该组织的目的。间充质干细胞在适当的条件下，具有强大的增值能力和分化能力，能够修复多种组织损伤，包括骨骼，肌肉，神经等组织，因此，间充质干细胞在再生医学治疗领域引起了越来越多的重视。

已经证明血液中含有分化能力较高，免疫排斥反应较小的间充质干细胞。各级血库、脐带血银行的建立为实现自体细胞移植提供基础。但是，由于血液中间充质干细胞含量极低（以脐带血为例，1×10⁸个单核细胞中仅含有0.5-30个，而成年血液中干细胞数量远低于此数量），因此如何高效分离和扩增这些细胞成为了阻碍血液间充质干细胞向临床转化的难题。目前，多利用该细胞在培养皿的吸附能力，对脐带血间充质干细胞进行分离，但是成功率低，并且在扩增过程中难以保持干细胞特性。本发明包括利用高分子化学材料对培养皿进行修饰，配合添加多种生长因子的培养基，构建血液间充质干细胞扩增环境，实现了该细胞的高效扩增和分离。

骨髓当中含有丰富的间充质干细胞，因此得到了最为广泛和深入的研究。研究证实，骨髓间充质干细胞表达特定的表面抗原表型，比如，CD45-，CD34-，CD29+，CD90+，CD73+和CD105+。在体外和体内环境中可向骨骼，软骨，神经以及胰岛等细胞分化。另外，骨髓间充质干细胞具有免疫调节的功能，分泌多种免疫相关信号分子，从而在免疫性疾病治疗过程中发挥作用。但是，尽管骨髓间充质干细胞细胞较易分离和培养，但是，骨髓来源有限，难以满足临床大量的需求。即便是进行病人的自体移植，患者也必须承担额外的痛苦。在其他组织，比如肌肉，脂肪，脑以及血液等其它组织也能分离获得间充质干细胞。这些细胞有与骨髓间充质干细胞相似的抗原表型和分化能力。然而，除去血液外，应用其他组织的间充干细胞面临着和应用骨髓间充质干细胞相同的问题，及样品稀缺，不足以满足临床需求。

已经证实，血液中含有活性很强的干细胞群，包括造血干细胞和间充质干细胞。血液中的间充质干细胞与骨髓干细胞相似，有着相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文献表明，血液干细胞有着更原始的干细胞特性和更低的免疫原性。同时，应用血液治疗糖尿病，神经损伤以及血管坏死等疾病也屡见报道。

发明内容

本发明的方法通过获取血液，利用特定的高分子化学物质而不是使用成分难以确定的细胞外基质，对其中的间充质干细胞进行分离纯化，并配合适当的培养基，实现对血液的高效扩增。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种分离和扩增血液间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

步骤a：收集血液样品，

步骤b：分离血液样品中单核细胞成分，

步骤c：将单核细胞成分接种于高分子材料修饰的培养皿，

步骤d：分离间充质干细胞，

步骤e：培养和扩增间充质干细胞。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液样品自医院采集，或自血液库中获取。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液样品是人的血液样品。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液样品采集自于早产或正常分娩胎儿以及成年人血液。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述血液样品均经过肝素抗凝，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单核细胞成分之后进行接种。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤c中，高分子材料是指聚乙二醇（PEG）和精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)（RGD）按同种浓度1ml：0.01g混合。本发明提出聚乙二醇（PEG）和精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)（RGD）1ml:0.01g的比例混合，可以比较好的分离和纯化血液中的间充质干细胞，从而既提高了分离纯化效率，也避免了使用化学成分极其复杂的细胞外基质。

根据本发明的另一个实施例，进一步包括所述步骤e中，培养和扩增间充质干细胞是指应用血液间充质干细胞培养基进行培养和扩增。