[发明专利]一种二化螟幼虫脂肪体细胞系的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及属于昆虫细胞培养技术领域，尤其涉及一种二化螟幼虫脂肪体细胞系的构建方法。

背景技术

随着生命科学的迅猛发展，在生物工程技术领域中，细胞工程已愈来愈受到重视。培养昆虫细胞作为研究材料，一直是细胞生物学、分子生物学和生物化学以及昆虫毒理学等科学研究的重要方面。

自从Grace在1962年首次建立天蚕蛾细胞系以来，昆虫细胞培养技术得到了迅速发展，目前已建立了800多株昆虫细胞系，主要集中于鳞翅目、双翅目（潘李珍等，1980,1989；曾庆韬等，1998）、鞘翅目（Lynn et al., 1995; Iwabuchi, 1999; Stiles, 1992）、直翅目（Heinandez-Crespo et al., 2000）、膜翅目、同翅目和半翅目等，其中大部分来自鳞翅目和双翅目，来源于其他目的昆虫细胞系仅占1/10左右（张寰等，2007）。昆虫细胞系的建立，不但促进了昆虫生物学方面的基础研究，也大大促进了基于昆虫细胞的应用性研究。其中，昆虫细胞-杆状病毒表达系统（BEVS）是当今最具高效的真核表达系统，已广泛应用于β-干扰素等外源基因的表达。

在所建立的昆虫细胞系中，研究和应用最多的是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）S2细胞系、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）的BTI-Tn-5B1-4（High Five）细胞系和草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf21细胞系及其克隆株Sf9等。相对于已知的上百万种昆虫以及昆虫细胞系的广泛用途来说，已经建立的细胞系还远远不够，仍需要建立更多的昆虫细胞系以满足实际需要。

二化螟Chilo suppressalis（Walker）属鳞翅目，螟蛾科，是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，在分蘖期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成虫伤株和白穗，一般年份减产3%～5%，严重时减产在3成以上。除危害水稻外，二化螟还危害玉米、甘蔗、粟、蚕豆、茭白、高粱、油菜、小麦、紫云英等作物。二化螟有很强的适应能力，能快速适应不利环境（如抗性品种和杀虫剂），其致害性能快速变异。在二化螟的防治过程中，新型生物农药的筛选和鉴定日益成为研究重点。生物农药的活动生物测定需要大量发育一致的二化螟试虫，对饲养场地要严格的要求，工作量大，而若有离体培养的二化螟细胞，则可以在离体条件下研究生物农药对二化螟的作用，从而有助于在细胞水平研究杀虫剂对二化螟的作用机制，有助于当前杀虫剂的改进和新杀虫剂的发明。目前，关于二化螟细胞的体外培养技术及二化螟细胞系，还未见报道。因此，通过本发明，建立二化螟细胞系，不仅能增加我国新昆虫细胞系的数量及种类，还能为日后该类昆虫细胞系的建立提供借鉴经验。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种二化螟幼虫脂肪体细胞系的构建方法。

二化螟幼虫脂肪体细胞系的构建方法包括如下步骤： 

（1）配制细胞原代培养液和细胞传代培养液；

（2）在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒10～20分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫2～3次，用无菌滤纸吸干虫体或用吹风机吹干虫体；

（3）将虫体置于用70%或75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，用消毒解剖剪从背部剪开二化螟，操作时尽量保持其完整，注意不能触破昆虫的消化道等同体外直接相连的部分；用消毒过的尖头镊取出脂肪体；

（4）将脂肪体放入盛有HBSS清洗液的培养皿中，用HBSS清洗脂肪体2-3次，然后再用细胞培养液TNM-FH清洗脂肪体1次，HBSS清洗液含200U/ml的青霉素， 0.2μg /ml的链霉素, 0.5μg /ml的两性霉素B；

（5）将清洗过的脂肪体置于预先盛有1ml细胞原代培养液的T-25cm²细胞培养瓶中，放入27℃无光照的细胞培养箱中培养；

（6）过夜后，待组织或器官贴壁后，再加入2ml细胞传代培养液，使脂肪体大部分浸没在该传代培养液中，在与步骤（5）同样条件下培养，在加液的时候勿使组织悬浮在细胞传代培养液中；

（7）每隔10天吸出50%～70%量的细胞传代培养液，并同时换入吸出量的新的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。

所述的细胞原代培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清及饱和苯基硫脲的混合物，pH值为6.0-6.8。