[发明专利]从D-氨基酸制备L-氨基酸的方法

说明书

本申请是2005年1月27日提交的题为“从D-氨基酸制备L-氨基酸的方法”的中国专利申请200580005253.7的分案申请。

本发明涉及重组微生物，其与起始微生物相比具有更高浓度或活性的D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、NADH共底物再生酶、并且如果需要还具有过氧化氢酶，本发明还涉及通过使用这些微生物从D-氨基酸制备L-氨基酸的方法。

目前许多天然氨基酸是通过用遗传优化的细菌进行发酵而以对映异构体纯的形式而制备(de Graaf AA,Eggeling L,Sahm H2001.Metabolic Engineering for L-Lysine Production by Corynebacterium glutamicum.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.73:9-29；Sahm H,Eggeling L,Eikmanns B,Kramer R.1996,Construction of L-Lysine-,L-Threonine-,and L-Isoleucin Overproducing Strains of Corynebacterium Glutamicum.Ann N Y Acad Sci782:25-39)。

诚然，不是所有的蛋白质氨基酸（proteinogenic amino acids）并且仅极少数非天然氨基酸和D－氨基酸可以这种方式制备。由于对映异构体纯的氨基酸的化学合成非常昂贵，因此已经开发了一系列酶学方法，其中一些方法已经可以达到每年生产数吨的规模。

所述方法的范围包括从借助于酰基转移酶、酰胺酶、酯酶、海因酶（hydantoinase）、氨基酸氧化酶和蛋白酶的动态外消旋物裂解到利用裂合酶、氨基转移酶和脱氢酶的对映体选择性合成(Schmid A.et al.(2002)“The Use of Enzymes in the Chemical Industry in Europe”,Curr Opin Biotechnol13(4):359-366)。

除了对映体选择性合成法之外，动态外消旋物裂解（dynamisch kinetische Racematspaltungen）也特别有效，其中不希望的对映异构体被原位外消旋化。在动态外消旋物裂解中，通过组合D-或L-氨基酸氧化酶与非选择性化学还原初始亚氨基酸为主要氨基酸，也可以达到100％得率。然而，还原剂如NaBH₄必须以至少25倍当量过量应用，这样导致这种方法非常昂贵(Enright et al.,“Stereoinversion of Beta-and Gamma-Substituted Alpha Amino Acids Using a Chemo-Enzymatic Oxidation-Reduction Procedure”,Chemical Communications(2003),(20),2636-2637.)

本领域通常已知氨基酸脱氢酶对α-酮酸的氨基化。然而无可否认所得离析物与例如相应的外消旋氨基酸相比更加昂贵许多倍。

然而，通过联合氨基酸氧化酶与氨基酸脱氢酶，可以从氨基酸原位获得相应的酮酸。当这两种酶具有相反的对映体选择性时，D-氨基酸可以完全转变为L-氨基酸或者L－氨基酸完全转变为D-氨基酸。从外消旋物开始，从中可以产生对映异构体纯的化合物。

在此NADH共底物必须使用酶再生，因为其太昂贵以至于不能以化学计量的量应用。从其底物中释放二氧化碳并因此使得反应不可逆的酶如甲酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶(脱羧化)是特别适用的(Hanson,R.L.et al.“Enzymatic Synthesis of L-6-Hydroxynorisoleucine”,Bioorganic&Medicinal Chemistry(1999),7(10),2247-2252，及Nakajima N.et al.,“Enzymatic Conversion of Racemic Methionine to the L-Enantiomer”,Journal of the Chemical Society,Chemical Communications(1990),(13),947-8)。