[发明专利]一种洁净制备壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒基因载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒基因载体的制备方法，更具体地说涉及一种用离子液体作溶剂和催化剂洁净制备壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒基因载体的新方法。

背景技术

基因治疗通过将外源基因导入到靶细胞核内以修复导致疾病的缺陷基因或者抑制导致疾病的有害基因，从而使机体恢复正常功能，达到治疗疾病的目的【专利CN102140171B，用作非病毒基因载体材料的谷胱甘肽修饰壳聚糖共聚物及其制备和应用】。基因治疗技术为常规医疗手段难以治愈的疾病提供了新的治疗方法。分子生物学的发展和人类基因库的建立推动了基因治疗的临床应用，使其不仅在治疗遗传性先天疾病和恶性肿瘤等领域发挥优势，并且越来越广泛的应用于各种普遍性疾病的治疗。基因治疗的关键在于开发安全、高效的基因递送载体。

基因递送载体分为病毒和非病毒载体两类。近年来，非病毒载体由于免疫原性低、携带基因能力强、易于批量生产等优点得到快速发展。非病毒基因载体主要包括脂质体和阳离子聚合物如壳聚糖、聚乙烯亚胺等。壳聚糖，唯一一种天然阳离子碱性多糖，具有良好的生物降解性、生物相容性、低细胞毒性等优点，其所携带的氨基阳离子能够复合DNA形成纳米微球，正成为非病毒基因载体的热门研究内容之一。但壳聚糖转染效率低。聚乙烯亚胺是一种具有较高转染效率的阳离子聚合物，分子中所含的大量伯胺和肿胺基团使它具有很强的质子缓冲能力，被细胞内吞之后能够引起溶酶体破裂使所携带的DNA快速逃离溶酶体免受溶酶体酶的吞噬。但其表现出的高细胞毒性限制了它的进一步临床应用，低分子量的聚乙烯亚胺毒性有所降低，但转染效率也同时降低了【Gene Therapy,1997,4，773-782，Polyethylenimine is a simple,inexpensive and effective reagent for condensing and linking plasmid DNA to adenovirus for gne delivery.】。结合壳聚糖的生物相容性和聚乙烯亚胺的转染效率，对壳聚糖进行聚乙烯亚胺接枝，可以达到提高壳聚糖基载体基因转染效率的目的。但壳聚糖的高结晶性和难溶性使得许多对其改性修饰的化学反应只能在多相介质中进行，加之壳聚糖分子内和分子间的氢键作用，导致多相反应只能在其表面上进行，产率低，副产物多【化工学报，2010，61，3030-3024，壳聚糖在离子液体中的均相接枝共聚】。寻找有效溶解壳聚糖的绿色溶剂，使壳聚糖接枝聚乙烯亚胺在均相条件下洁净反应，成为壳聚糖基载体改性修饰过程中亟待解决的问题。

离子液体是一类由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的盐类化合物，是一种新型绿色溶剂和催化剂，具有低毒、无味、蒸汽压高、常温液态、组分可调等优点。离子液体作为均相反应介质己成为绿色化学领域的研究热点【中国科学B辑：化学，2009，39，1134-1144，离子液体的前沿、进展及应用】。从目前文献的调研结果看，尚未有任何报道是以离子液体为溶剂，均相合成壳聚糖接枝聚乙烯亚胺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种用离子液体作为溶剂均相合成壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒基因载体的新方法。

本发明的技术方案为：

一种清洁制备壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒基因载体的方法，该方法以含有咪唑类阳离子的离子液体作为反应介质，将聚乙烯亚胺与壳聚糖经羰基化反应共价接枝制备得到壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒基因载体。

本发明中，所述含有咪唑类阳离子的离子液体为1,3-二烷基咪唑类阳离子和阴离子构成的离子液体，具有通式I的结构：

其中：

R₁和R₂各自独立选自H或C_1-10的烷基。

Xˉ选自氯离子、溴离子、氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子、六氟锑酸根离子、六氟硒酸根离子或氯铝酸根离子。

进一步，所述R₁和R₂各自独立选自C_1-4的烷基，更优选R₁和R₂各自独立选自丁基，甲基。

进一步，所述Xˉ选自氯离子、氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子或氯铝酸根离子，更优选选自氯离子和氯铝酸根离子。

在本发明优选的技术方案中，所述清洁制备壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒基因载体的方法，包括如下步骤：