[发明专利]一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒。

背景技术

蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia Stiles，GL），简称贾第虫，又称兰布尔吉亚尔氏鞭毛虫或梨形鞭毛虫，属于鞭毛虫纲，蓝氏贾第鞭毛虫能够引起一种以腹泻为主要症状的肠道疾病。蓝氏贾第鞭毛虫寄生人体小肠、胆囊主要在十二指肠，可引起腹痛、腹泻和吸收不良等症状，当虫体蓝氏贾第鞭毛虫寄生在胆道系统时，可能引起胆囊炎或胆管炎。

现有技术中对蓝氏贾第鞭毛虫的快速检测方法为实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术，实时荧光定量PCR技术与传统的核酸扩增技术方法相比，避免了核酸扩增技术的污染以及检测结果易出现假阳性或假阴性结果的问题，且实时荧光定量PCR技术比核酸扩增技术的检测结果特异性更高。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

虽然实时荧光定量PCR技术检测的结果特异性高，但仍不能达到100%的特异性和准确性，使得现有的检测方法并不能准确地检测出人体上是否寄生有蓝氏贾第鞭毛虫。

发明内容

为了解决现有技术中检测方法不准确的问题，本发明实施例提供了一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物、荧光探针和试剂盒。所述技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物，

所述正向引物如序列表中SEQ ID NO.1。

所述反向引物如序列表中SEQ ID NO.2。

所述荧光探针如序列表中SEQ ID NO.3。

所述荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的所述荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

另一方面，本发明提供了一种用于检测蓝氏贾第鞭毛虫核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和荧光探针。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应液、核酸释放试剂、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品，其中：

所述PCR反应液包括：无菌水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer和含Mg离子的溶液。

所述核酸释放试剂由无菌水、Triton-X100、NP-40和Tris-HCL组成。

所述阴性质控品为不含蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的pUC57-T载体质粒DNA。

所述阳性质控品为1.0×10⁶IU/mL含所述蓝氏贾第鞭毛虫的基因组DNA片段。

所述临界阳性质控品为1.0×10⁴IU/mL含所述蓝氏贾第鞭毛虫的基因组DNA片段。

具体地，所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。

进一步地，所述PCR反应液中所述Taq酶的终浓度为0.01U/μL～0.05U/μL，所述dNTPs的终浓度为0.2～0.6mM，所述10×PCR Buffer的终浓度为1×，所述MgCl₂的终浓度为1.5～5.0mM，溶剂为无菌水。

具体地，所述正向引物的终浓度为0.05～0.9μM，所述反向引物的终浓度为0.05～0.9μM，所述荧光探针的终浓度为0.05～0.9μM。

具体地，所述核酸释放试剂中Triton-X100的终浓度为0.03～0.3%、NP-40的终浓度为0.04～0.4%以及pH值为8.3的Tris-HCL的终浓度为0.01～0.1M，溶剂为无菌水。

进一步地，所述Tris-HCL的pH值为8.3。

进一步地，所述试剂盒还包括工作标准品，所述工作标准品为含有所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的72个碱基对的核苷酸片段的pUC57-T重组质粒DNA。

具体地，所述工作标准品包括：

工作标准品1，含有1.0×10⁷IU/mL所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的非传染性DNA片段。

工作标准品2，含有1.0×10⁶IU/mL所述蓝氏贾第鞭毛虫的β贾第素基因的非传染性DNA片段。