[发明专利]一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA病毒基因组的改造方法，尤其涉及一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法。

背景技术

目前对于DNA病毒基因组的定点突变，主要有两种方法，一种方法是借助于限制性内切酶等工具酶对病毒基因组进行细胞外的基因重组操作，但对于较大的病毒基因组，很难找到可以使用的单个限制性酶切位点。另一种方法是借助于细胞内的同源重组系统，通过向病毒感染细胞中转染与病毒基因组相似的同源序列，完成对特定区域基因组序列的定点编辑，由于这种同源重组效率极低，因此并不适合高通量的病毒疫苗株筛选，为了克服这种困难，往往需要向病毒导入外源性抗性基因用于重组病毒的筛选，这种操作不但费时费力，而且在生物安全性上并不适合疫苗株的要求。如何简单、高效、精确地对大型DNA病毒基因组进行定点编辑，仍是疫苗开发中的一个技术瓶颈。

在申请号为201310364133.2，公开日为2013年11月20日的名称为“一种DNA病毒基因组的定点改造方法”的发明专利申请中公开了一种能够高效地对病毒基因组进行定点突变、定点基因敲除或提高外源基因插入病毒基因组的重组效率、以及简化重组的定点改造方法，但是其所产生的突变类型具有很大的随机性，这种随机突变不能严格达到对生物安全的要求，也常常无法满足在产品开发过程中需要在特定的病毒基因组位点精确插入或缺失数个碱基以及突变为特定的目标序列。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明的目的是提供一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，解决现有的DNA病毒基因组定点改造方法存在的突变类型具有很大的随机性，且这种随机突变不能严格达到对生物安全的要求，也常常无法满足在产品开发过程中需要在特定的病毒基因组位点精确插入或缺失数个碱基以及突变为特定的目标序列的问题。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种特异性的DNA病毒基因组定点改造及筛选方法，是通过以下步骤实现的：

步骤一，构建定点切割的核酸酶系统：构建包含导向功能的分子和具有定点切割单链DNA活性的蛋白核酸酶系统Ⅰ，以及包含导向功能的分子和具有定点切割双链DNA活性的蛋白核酸酶系统Ⅱ；

步骤二，构建包含有特异性突变、缺失或插入序列的同源序列；

步骤三，将步骤一构建的蛋白核酸酶系统Ⅰ和步骤二构建的同源序列共同转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统Ⅰ的质量之间的比例为1×10⁵:0.1-2μg，控制细胞数量与同源序列的质量之间的比例为1×10⁵:0.1-2μg；

步骤四，向经步骤三处理后的细胞培养板的每个孔中加入病毒液，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞病变，得到病变细胞Ⅰ；

步骤五，收集步骤四得到的病变细胞Ⅰ和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液P1；

步骤六，将步骤一中构建的蛋白核酸酶系统Ⅱ转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统Ⅱ的质量之间的比例为1×10⁵:0.1-2μg；

步骤七、向经步骤六处理后的细胞培养板的每个孔中加入步骤五得到的子代病毒收获液P1，吸附，然后吸去病毒液，再加入细胞维持液，培育至细胞病变，得到病变细胞Ⅱ；

步骤八，收集步骤七得到的病变细胞Ⅱ和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液P2；

步骤九，从步骤八得到的子代病毒收获液P2中，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，分离出纯化获得具有特异性突变的子代病毒；完成DNA病毒基因组的特异性定点改造及筛选方法。

进一步的技术方案是，将上述步骤九得到的具有特异性突变的子代病毒，可通过任选嗜斑法或有限稀释法之一，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，获得改造后的目的重组病毒。其中，除了进行核酸测序检测以外，也可以通过核酸杂交、抗性筛选、报告基因检测、蛋白丰度以及蛋白特异性检测等多种方法进行鉴定。

本发明中，具体地，所提及的病毒包括所有以DNA为遗传物质的病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、卡波氏肉瘤病毒、痘病毒等病毒以及经过人工重组的嵌合病毒等。

本发明步骤一中构建至少一个核酸酶系统Ⅰ，比如构建2个核酸酶系统Ⅰ，步骤三中可以同时采用2个单链核酸酶系统Ⅰ进行转染细胞，其精确控制突变的也较单点切割双链的效果要好。