[发明专利]一种检测EGFR基因外显子20 T790M点突变的试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域和核酸检测领域，具体为检测表皮生长因子受体EGFR基因外显子20上T790M点突变的方法。 

背景技术

随着个体化医疗观念的不断深入，检测特定基因突变可以给医生的个体化诊疗提供靶向用药的参考。受体酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是近年来肺部肿瘤治疗的热点靶向药物，与传统放化疗药物相比，可明显延长肿瘤患者生存期，改善生存质量。 

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶区域发生突变，可使酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌的有效率达到80%以上。由于EGFR基因突变是一种体细胞遗传突变，迄今为止的资料证明此类突变仅发生在癌细胞中，正常组织细胞均属于无突变的野生型。 

EGFR蛋白酪氨酸激酶功能区由EGFR基因外显子18-24编码，其中外显子18-20编码N-Lobe，外显子21～24编码C-Lobe。迄今为止发现的EGFR突变主要位于外显子19至21。 

外显子20上的T790M突变是目前较为认可的耐药机制之一，通常是替代的点突变，2669位点上的C突变为T。 

目前基因变异的检测技术主要有直接测序法（亦称Sanger测序法）和ARMS法。现分别简介于下： 

Sanger测序法，即Sanger（桑格）双脱氧链终止法是Frederick Sanger于1975年发明的。测序过程需要先做一个聚合酶链式反应（PCR）。PCR过程中，双脱氧核糖核苷酸可能随机的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于双脱氧核糖核苷酸多脱了一个氧原子，一旦它被加入到DNA链上，这个DNA 链就不能继续增加长度。最终的结果是获得所有可能获得的、不同长度的DNA片段。目前最普遍最先进的方法，是将双脱氧核糖核苷酸进行不同荧光标记。将PCR反应获得的总DNA通过毛细管电泳分离，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下发出荧光。由于ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4种双脱氧核糖核苷酸）荧光标记不同，计算机可以自动根据颜色判断该位置上碱基究竟是A，T，G，C中的哪一个。直接测序法耗时长(一般需2－3天)且灵敏度低，仅能检出突变比例在10%～20%以上的突变。 

ARMS法也称扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、等位基因特性PCR（Allele Specific PCR，ASPCR）等，即等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，ASA）建立于1989年，是PCR技术应用的发展。 

ARMS法主要用于对已知突变基因进行检测。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，首先设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补。对于纯合性突变，分别加入这两种引物及下游3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于上游5’端引物的3’端，则引物与模板DNA不配对，导致PCR不能延伸，因此这种方法称为ARMS，可选择性地扩增突变型DNA模板。 

上述现有技术存在以下问题： 

1.均为定性检测，也就是说只能给出基因变异是否存在的结论。但无法测定携带基因变异的DNA量的比例，也就是说难以进行定量检测。 

2.均给出模拟图结果，需要人工进行判读，判读方面相对比较主观。无法直接得到数字化的客观结果。 

3.灵敏度比较差，目前方法的灵敏最好为1%，无法满足某些特定的临床检测需求。 

目前的检测一般需要通过有创性组织活检，且不易重复获取。研究表明，在血液、胸腔积液、唾液、粪便等样本中，会有少量混杂于大量野生型基因组DNA中的突变肿瘤细胞DNA。从这些低含量样本中检测突变的基因，需要找一种灵敏性高、特异性强、简便易行、结果判定简单的突变检测方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因外显子20T790M点突变的PCR扩增引物、TaqMan探针及试剂盒和检测方法。