[发明专利]一种新的融合蛋白及用其制备的嗜肺军团菌疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种新的融合蛋白及用其制备的嗜肺军团菌疫苗。

背景技术

嗜肺军团菌（Legionella pneumonia）广泛存在于自然界各种水体环境中，属于革兰氏阴性兼性胞内致病菌，可寄生于原虫中，作为一种病原体，它可侵入哺乳动物巨噬细胞，逃避吞噬体和溶酶体的杀伤作用，并在其中繁殖。

嗜肺军团菌可以感染人体或动物体，引起一种以非典型肺炎或pantiac热为主要表现常伴有多系统损害的急性细菌性传染病——军团病，病程进展快，免疫功能低下者易感染，由于其症状不典型，常备误诊误治，病死率高，易爆发流行，国外监测结果显示，嗜肺军团菌病例数逐年升高，且致死率较高，其引起的常见并发症如脓毒血症、多器官衰竭、间歇性肺炎、肺纤维化致死率均较高(Huang SW,Hsu BM,et al.Water Sci Technol,60(5):1303-1310,2009)，必须引起重视。

目前，军团病的治疗主要采用大环内酯类和喹诺酮类抗生素，但其临床有效率较低，还会导致机体产生耐药性。接种疫苗是一种比较好的防治方式，然而，尽管嗜肺军团菌疫苗的研制已有近20年的历史，也出现了灭活全菌疫苗、蛋白亚单位疫苗、基因疫苗等疫苗，但都引起各自的不足难以在临床推广应用，如，全菌体灭活疫苗在人类群体中普遍存在多种较严重的不良反应，DNA疫苗的研究虽然具有良好的实验前景，但其作用机制尚不明确，应用于人体后其安全性有待进一步评价，目前制备的亚单位疫苗对胞内菌清除效果不佳，免疫保护性低。

因此，研发安全有效的嗜肺军团菌疫苗成为迫切需要解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的融合蛋白及其用其制备的嗜肺军团菌疫苗。

本发明融合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.1所示的。

本发明重组载体，它包括SEQ ID NO.1核苷酸序列。优选地，它是pET30a重组载体。

本发明重组菌，它包括前述的重组载体。优选地，它为重组大肠杆菌。

本发明制备前述融合蛋白的方法，它包括如下步骤：

（1）取前述重组菌，接种到大肠杆菌培养基中，34～40℃培养至OD₆₀₀=0.6～0.8；

（2）加入IPTG至终浓度为0.4～0.6mmol/L，在15～25℃的条件下，诱导培养8～16小时；

（3）收集菌体，超声破菌，离心，取沉淀分离纯化，即得。

步骤（1）中，大肠杆菌培养基为LB液体培养基，培养温度为37℃。

步骤（2）中，IPTG的终浓度为0.5mmol/L，温度为21℃，培养时间为12h。

步骤（3）中，所述超声破菌的步骤是：将菌体置于10mmol/LTris-HCl溶液中，在功率500W的条件下处理30次，每次10s，间隔15s。

步骤（3）中，所述分离纯化方法的步骤如下：

a、蛋白变性：将沉淀用10mmol/L的Tris-HCl溶液重悬沉淀，静置10min，离心，弃上清；重复一次；用含有尿素的浓度为10mmol/LTris-HCl溶液溶解沉淀，其中，尿素浓度为8mol/L，在12000rpm的条件下离心10min，收集上清；

b、蛋白复性：将上清用尿素浓度为6mol/L、4mol/L和2mol/L的缓冲液依次透析，前两个浓度分别透析3h，最后一个浓度透析12h，所述缓冲液中还含有1%（w/v）甘氨酸、0.1%（w/w）SDS、5%（v/v）甘油、10mmol/L Tris-HCl；再用含有1%（w/v）甘氨酸的浓度为10mM Tris-HCl溶液透析2次，每次3h；12000rpm离心10min，取上清，即可。

本发明还提供了前述融合蛋白在制备治疗和/或预防嗜肺军团菌感染性疾病的药物中的用途。优选地，所述嗜肺军团菌感染性疾病为军团病。

本发明还提供了一种嗜肺军团菌疫苗，它包括致免疫有效量的权利要求1所述的融合蛋白，以及药学上可接受的辅料或者载体。优选地，所述融合蛋白的免疫有效量以每人一次使用量计不低于0.11μg/g。

所述辅料或载体为水或缓冲液。优选地，所述水为生理盐水或蒸馏水。