[发明专利]一种用于检测保健食品中不得检出的致病菌核苷酸片段的引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测保健食品中“不得检出”的致病菌核苷酸片段的引物和探针。 

背景技术

保健(功能)食品是食品的一个种类，具有一般食品的共性，能调节人体的机能，适于特定人群食用，但不以治疗疾病为目的。在保健品的生产、销售与进出口贸易中，致病菌的污染亦成为重要的安全隐患。现行有效的保健（功能）食品通用标准GB16740-1997中规定致病菌（指肠道致病菌和致病性球菌）不得检出。我国将致病菌按其是否致病、致病力强弱、感染途径、危害人体的严重性、传染性的大小、当地人群的免疫水平、有无免疫制剂和特效治疗药物等分为1、2、3类和非致病菌，目前无微生物属于第1类致病菌。第2、3类致病菌中的肠道致病菌、致病性球菌和常见的医源性条件致病菌主要种属及其代表性致病性菌株如下表1所示。由于食品行业长期执行的“不得检出”的标准，因此对常见致病菌均具有高效灵敏检出效果的通用型方法在保健食品的致病菌检测中十分必要，不仅能降低逐项检测致病菌造成的巨大工作量，也能降低检测成本缩短检测时间，在致病菌污染的监控方面起着重要的作用。 

表1保健食品中常见的“不得检出”致病菌种属 

到目前为止，至少发现20个种属的60多种细菌存在VBNC（viable but non-culture）状态，处于此状态的致病菌不具备可培养性但却仍具备致病性，传统的基于生化培养的检测方法无法检出，采用通用型核酸探针可避免VBNC状态菌的漏检。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。对多种致病菌同时检测有两种方式，一种是多重荧光PCR，但多重荧光PCR使用的是带荧光标记的核酸探针面临多组引物之间相互干扰、引物间的碱基配对进行非特异性扩增，不同种类核酸片段扩增效率不一致，高浓度模板对低浓度模板产生竞争性抑制等问题，还未能满足对多种致病菌的同时检测；另一种是核酸探针与基因芯片的结合，但基因芯片技术要求一套完整的引物与核酸探针，设计芯片和结果分析过程都比较复杂，且制作成本昂贵。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测保健食品中常见的“不得检出”的致病菌核苷酸片段的引物和探针，该引物和探针具有高度的特异性、敏感性、快速简便、费用较低等特点，还能同时对保健食品中常见的“不得检出”的多种致病菌核苷酸片段进行检测。 

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种用于检测保健食品中常见的“不得检出”的致病菌核苷酸片段的引物和探针，所述的引物由上游引物Bac F1a和下游引物Bac R1组成，所述的上游引物Bac F1a的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物Bac R1的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述的探针为Bac Pb1探针，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。 

本发明用于检测保健食品中常见的“不得检出”的致病菌核苷酸片段的引物和探针还可以是：本发明所述的引物的上游引物由碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的上游引物Bac F1a向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基组成；所述的下游引物由碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的下游引物Bac R1向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基组成；所述的探针由碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所述的Bac Pb1探针向3’端方向延 伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基组成。 

本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTP）等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。 

与现有技术相比，本发明具有如下优点： 

（1）本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达100个拷贝/mL，说明其具有良好的灵敏度；