[发明专利]一种甲肝病毒定量检测用质粒标准分子

说明书

技术领域

本发明属于生物分析测试、临床医学检验和环境监测技术领域，具体涉及一种甲肝病毒定量检测用质粒标准分子。 

背景技术

甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV)感染能引起急性病毒性肝炎的，是一种重要的食源性肠道病毒，隶属于小RNA病毒科肝病毒属，病毒颗粒无囊膜，呈二十面体对称结构，直径为27nm-32nm，其中包含一条正链RNA基因组，长度为约7.5kb。甲型肝炎病毒主要通过粪口传播，摄入被甲肝病毒污染的食物和水是造成甲型肝炎传播的最主要原因。 

甲型肝炎病毒在食物和环境中广泛存在，虽不易导致慢性感染，但常可造成暴发流行，给国家和人民的生命财产造成重大损失。食物在收获前、收获后、从农场到餐桌的各个阶段都可能被甲肝病毒污染。涉及到甲型肝炎暴发的最常见的食品主要是生鲜农产品和速食食品，这些在食用前都没有经过加热处理步骤。2005年，宾夕法尼亚州的一家餐厅发生甲肝病毒感染事故，系食用被甲肝病毒污染的大葱所致，造成600多人患病，其中3人死亡。另外，随着环境污染越来越严重，由水体传播引发的病原性疾病已成为世界范围内人们所关注的问题之一。目前，许多国家包括中国都采用粪便污染指示菌例如粪大肠菌群、总大肠菌群、肠球菌来评价水体的污染状况，而没有将涉水病毒的检测包括在内。但是研究发现，水环境中细菌水平与病毒浓度之间无明显相关(Tree,Adams et al.2003)，并且有些病毒对外界环境和消毒作用的抵抗力更强，细菌指示的使用不足以对已处理水质或水体的污染状况进行检测或评价，在满足水体细菌卫生学标准时仍能检测到病毒。在我国，因水体污染造成的甲肝流行时有发生。1988年，上海爆发了一次医学史上规模最大的甲肝大流行，系食用由甲肝病毒污染水体中养殖的毛蚶造成。2003年，重庆市垫江县长龙乡长久村小学出现甲肝疫情，53名学生被确诊为甲肝患者，甲肝爆发的原因是学生饮用被甲肝病毒污染的水源。2008年广西接连发生2起甲肝疫情，造成约200名学生被感染，经疾控人员调查，引发疫情的原因都是学校的饮用水源受到了污染。食物与水环境与人们的生活、生产密切相关，因此甲肝病毒的检测及溯源研究十分重要，应引起学界及有关部门的高度重视。 

直接对病毒进行检测可以提供更可靠的甲肝病毒污染信息，进一步确保食物和饮水安全。但是，迄今国内外尚未制定统一可行的甲肝病毒的检测方法，而且针对甲肝病毒进行定量检测的标准质粒尚未报道。因此，构建用于对甲肝病毒进行特异性定量检测的质粒标准分子非常急需。 

发明内容

本发明的目的是构建一个应用于甲肝病毒特异性定量检测的质粒标准分子，在利用实时荧光定量PCR方法对甲肝病毒进行特异性定量检测时，该甲肝病毒质粒标准分子被用作为阳 性标准品。 

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案： 

本发明提供的甲肝病毒特异性定量检测用质粒标准分子，其含有SEQ ID NO:1所示序列，该序列含有甲肝病毒基因组中编码VP1-VP3衣壳蛋白的247bp保守区域基因片段。 

所述的SEQ ID NO:1片段构建于pGEM-T（promega）载体上。 

所述的SEQ ID NO:1片段是由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成引物对，对甲肝病毒进行特异性扩增，获得247bp扩增子。 

根据所述的SEQ ID NO:1片段设计SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成引物对，对甲肝病毒基因组中VP1-VP3衣壳蛋白的247bp保守区域基因片段中112bp基因片段进行特异性检测。 

本发明提供的上述甲肝病毒特异性定量检测用质粒标准分子，其应用于甲肝病毒及含有该病毒的样品的特异性且定量检测中。 

该甲肝病毒特异性定量检测用质粒标准分子替代甲肝病毒基因组，作为甲肝病毒特异性定量检测的阳性标准品。 

本发明与现有技术相比主要有以下效果： 

本发明提供了量值可以溯源的甲肝病毒质粒标准分子，不仅可以定量检测甲肝病毒，而且可以提高检测的准确性、可靠性。本发明的质粒标准分子无需进行任何处理，只需要在检测过程中与待测样品一起使用，即可给出待测样品中甲肝病毒的含量。 

附图说明

图1是甲肝病毒VP1-VP3保守区域的247bp片段扩增电泳结果，其中左侧条带1和2为甲肝病毒247bp片段，3为DL2000DNA maker，4为阴性对照；