[发明专利]一种桃芽变鉴定方法

说明书

技术领域：

本发明属于园艺作物育种领域，涉及果树新品种选育方法，尤其是一种桃芽变鉴定方法。

背景技术：

果树芽变选种具有育种周期短、育种进程快的特点，是种质资源创新的重要途径。芽变是体细胞突变的一种，是植物芽的分生组织体细胞发生的突变。芽变一般表现在枝、叶、花、果及物候期、成熟期等特征和特性上。选择突变芽及其成长的枝，经过无性繁殖可以创造出新品种称芽变选种。例如元帅系苹果中的许多品种，都是利用芽变选种所得。

桃是容易出现芽变的果树之一，采用芽变选种已经培育出了许多优良新品种，但是桃芽变的鉴定技术仍然不够成熟，主要是无法准确区分芽变和饰变。芽变是植物遗传物质发生了变化，而饰变不是遗传物质变化造成的，而是由于外界环境条件（如砧木、肥水、土壤、气象因子及生物因子等）的影响，在外在形态上发生了变化。传统的芽变鉴定主要通过形态学的观察比较，但是有些情况下，芽变和饰变的形状特征非常相似，仅通过形态学观察无法准确判断。因此，开发准确鉴定芽变的新技术，对于加速育种进程，减少劳动力和土地消耗，降低育种成本等具有重要意义。

嫁接是植物的人工营养繁殖方法之一，即把一种植物的枝或芽，嫁接到另一种植物的茎或根上，使接在一起的两个部分长成一个完整的植株。果树生产中，品种苗通常都采用嫁接繁殖获得。

高等植物基因组存在大量重复序列，简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)是其中一类，也称微卫星DNA，其串联重复的核心序列为1-6bp，其中最常见是双核苷酸重复，即(CA)n和(TG)n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10-60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们发展了SSR标记由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。

相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)标记技术是一种新型的基于PCR扩增的分子标记技术，其上游引物长17bp，针对基因外显子里GC含量丰富而启动子和内含子里AT含量丰富的特点来设计引物进行扩增，因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。SRAP标记的基本原理：利用SRAP技术设计引物很关键，它是通过特殊引物对开放阅读框（ORFs）进行扩增。正向引物（F-primer）含17个碱基，5′端的10bp是一段非特异性的填充序列，接着是CCGG序列，这14bp组成核心序列，最后是3′端的3个选择性碱基，对外显子进行扩增，反向引物含18个碱基，在5′端前11个是填充序列，和紧接的AATT组成核心序列，3′端是3个选择碱基，对内含子区域和启动子区域进行扩增，由于不同个体及物种的内含子、启动子与间隔序列变异很大，所以产生多态性扩增产物。SRAP是一种基于PCR的新型分子标记技术，它无需任何序列信息即可直接扩增，具有简单快捷的优点，同时兼具多态性和稳定性，还具有可靠性好、重复性高、快速、易于测序等特点，是简单、经济又有效的方法。

发明内容:

本发明的目的在于提供一种桃芽变的鉴定方法，通过本方法中提供的引物对，能够找到并确定桃芽变植株。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种桃芽变的鉴定方法，包括以下步骤：

首先进行连续三代嫁接鉴定，观测表型性状的稳定性，对于连续三代嫁接后，性状稳定的疑似芽变，采集嫩叶和亲本的嫩叶，提取基因组DNA，分别用SSR引物和SRAP引物对DNA进行PCR扩增，然后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳区分芽变，亲本及疑似芽变品种电泳条带有差异，则疑似芽变品种为芽变；