[发明专利]用于检测结核分枝杆菌mRNA的引物和探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于病原体检测领域，涉及一种用于检测结核分枝杆菌的引物和探针及其应用。

背景技术

结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，2010年新修订的《中华人民共和国国境卫生检疫法实施细则》中，明确规定卫生检疫机关应当阻止患有传染性肺结核病的外国人入境，而准确检测到具有传染性的结核分枝杆菌活菌是国境口岸拦截传染性肺结核的关键。灵敏度高，特异性强、检测时间短的PCR检测技术在防控结核工作中起着越来越重要的作用。针对结核分枝杆菌DNA和16S rRNA进行检测的PCR方法不能判断细菌在体内的活性，往往出现PCR扩增阳性而培养阴性的情况（陆宇，朱莉贞，段连山，等.mRNA作为结核分支杆菌活菌检测标志的可行性研究[J].中华结核和呼吸杂志,2003,26(7):419-423.）。

结核分枝杆菌信使RNA（mRNA），由于半衰期很短，仅存在于活的、有代谢活性的菌体中，因此是活动性结核的重要标志（Hellyer T J,Desjardin L E,Teixeira L,et al.Detection of viable Mycobacterium tuberculosis by reverse transcriptase-strand displacement amplification of mRNA[J].J Clin Microbiol,1999,37(3):518-523.Desjardin L E,Perkins M D,Wolski K,et al.Measurement of sputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for response to chemotherapy[J].Am J Respir Crit Care Med,1999,160(1):203-210.）。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测结核分枝杆菌的引物和探针及其应用。

本发明所提供的用于检测或辅助检测结核分枝杆菌的组合物，由一个引物对和一个探针组成的组合物；所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；所述探针的序列为序列表中序列3。

其中，序列1有19个核苷酸组成；序列2由18个核苷酸组成；序列3由22个核苷酸组成。

所述组合物中，组成所述引物对的两条单链DNA分子，以及所述探针，三者使用时的摩尔比为1:1:4；

TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光报告基团连接在探针的5’末端，荧光淬灭基团连接在探针的3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

所述荧光报告基团可为Joe(JOE)、Fam（FAM）、Hex(HEX)、Tet(TET)、Vic(VIC)、Fite(FITE)、Cy3(CY3)或Cy5(CY5)。所述荧光淬灭基团可为Bhq1(BHQ1)、Tamra（TAMRA）、Rox(ROX)、Dabcy(DABCY)或Bhq2(BHQ2)。在本发明中，所述探针5’端标记的荧光报告基团具体为JOE，3’端标记的淬灭荧光基团具体为BHQ1。

检测或辅助检测结核分枝杆菌的引物对或探针也属于本发明的保护范围。

所述引物对具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。所述探针可为TaqMan荧光探针，其核苷酸序列具体为序列表中序列3。在本发明中，所述探针5’端标记的荧光报告基团具体为JOE，3’端标记的荧光淬灭基团具体为BHQ1。

所述引物对中，所述两条单链DNA分子使用时的摩尔比为1:1。

上述组合物或引物对或探针在制备用于检测或辅助检测待测样品中是否含有结核分枝杆菌的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

含有上述组合物或引物对或探针的试剂盒也属于本发明的保护范围。

进一步，所述试剂盒中还可含有反转录酶和/或DNA聚合酶。