[发明专利]一种超敏的免疫电镜标记方法

说明书

技术领域

本发明属于现代生物医学技术领域，特别涉及一种超敏的免疫电镜标记方法。

背景技术

免疫电镜是利用免疫组织化学技术和电镜技术在超微结构水平上观察待测抗原在生物医学样品中的精确定位的方法。早年的免疫电镜技术使用的是酶标法，现在的免疫电镜技术往往使用的是金标二抗的方法。二抗也称为第二抗体，是一种蛋白质，可以与直径不同的金颗粒通过静电作用形成金标二抗，如果这种金标二抗与一抗结合，一抗再与其相应的抗原发生特异性偶联作用，在电镜下就会形成代表相应抗原表位的致密颗粒。目前使用金标二抗的免疫电镜技术分为包埋前免疫电镜和包埋后免疫电镜两大类。

包埋前免疫电镜，顾名思义就是在经过电镜技术的包埋程序之前就对待测生物样品进行免疫标记。一般而言，普通抗体的直径是10nm，在与金颗粒发生静电结合时，金颗粒的直径越小，附着在抗体周围的金颗粒也就越多,在标记、洗脱过程中也越不容易使金颗粒丢失，在电镜下显示的代表待测抗原表位的颗粒也就越多。也就是说，和二抗发生静电结合的金颗粒直径越小，在检测待测抗原时敏感性越高。但是如果直径太小，如金颗粒直径在0.8nm-1.4nm时，即使在电镜的高倍模式下也不容易观察到金颗粒，因此，包埋前免疫电镜技术往往需要利用银加强试剂，使以金颗粒为核心的位置再富集上直径5-50nm的银颗粒，从而间接显示出生物样品待测抗原的表位。

包埋前免疫电镜的优点：检测的敏感性高。因为包埋前免疫电镜使用的是直径是0.8nm-1.4nm的超微金颗粒，直径10-15nm的二抗很容易吸附如此细小的超微金颗粒，并且可以抵抗严格的漂洗条件。经过银加强步骤后，可以很敏感地显示待测抗原的精确表位，而且可以根据需要通过延长银加强试剂的孵育时间来控制超微金颗粒周围的富集的银颗粒直径，使其达到放大5-50倍的效果而不影响标记的敏感性。

包埋前免疫电镜的缺点。首先，只能标记样品浅层的样品（如实施例1）。吸附有直径是0.8nm-1.4nm的金标二抗，即使在加入穿透剂的情况下，其穿透能力非常有限，一般都会低于10μm，不能标记生物样品深层的抗原，对于大块的生物样品如脑片可以通过振动切片完成，如果是很小的生物样品如果蝇的胚胎、脑等器官，就很难达到标记效果。其次，为了增加待测样品的深度，包埋前免疫电镜操作程序中往往会使用一定浓度的非离子型去污剂Tween-20或者表面活性剂Triton X-100，这两类化学物质往往会造成生物样品超微结构损坏或者丢失，从而可能影响待测抗原的检测。再次，包埋前免疫电镜在使用银加强放大步骤时，由于生物样品的细胞内部结构和组分分布高度不均匀，银颗粒在金颗粒周围富集形成致密核心时，其穿透待测生物样品所进入的距离和路径不一致，将导致最后形成的银颗粒核心直径大小不一（如实施例1），如果这些直径相差较大，将会干扰对检测结构的判断，而且不能做定量分析。

包埋后免疫电镜，顾名思义就是在经过电镜技术的包埋程序之后才对待测生物样品进行免疫标记。

包埋后免疫电镜的优点。首先，可以检测生物样品内部的待测抗原。其次，包埋后免疫电镜不使用穿透剂，可以使待测生物样品的超微结构和待测抗原得到较好的保存；再次，根据金颗粒的数量，可以对待测样品作半定量分析。

包埋后免疫电镜的缺点。由于包埋后免疫电镜使用的金标二抗的金颗粒直径达到5-50nm，而与金颗粒结合的二抗直径大约为10-15nm，与之结合的金颗粒数量比包埋前免疫电镜使用的0.8-1.4nm的超微金颗粒数量低得多，而且在标记、洗脱过程中金颗粒容易丢失，因此包埋后免疫电镜标记的敏感性低（如实施例2），而且金颗粒越大，敏感性越低。另一方面，生物样品的超薄切片一般厚度为100nm左右，如果利用直径较大的金标二抗，其穿透样品的能力也会受到影响。因此，以包埋后免疫电镜技术检测生物样品的待测抗原，敏感性将降低。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术存在的问题和不足，本发明充分结合了包埋前免疫电镜和包埋后免疫电镜的优点，提供了一种超敏感的免疫电镜标记方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：一种超敏的免疫电镜标记方法，包括以下步骤：把生物样品待测抗原体积百分比为0.1-2.5%的戊二醛溶液和质量百分比为1.5-5%多聚甲醛溶液固定后，经过脱水程序后，经过亲水性树脂包埋，切成超薄切片后，分别用特定的第一抗体标记生物样品待测抗原，再以吸附超微金颗粒的第二抗体标记第一抗体，然后利用银加强放大试剂在超微金颗粒周围形成直径较大的银颗粒，然后在电镜下即可敏感地检测待测抗原在生物样品中的表位。