[发明专利]一种快速检测革兰氏菌的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及快速检测革兰氏菌，尤其是获取的快速检测革兰氏菌的方法与试剂盒，具有显著的使用效果，方法极为精准与便捷。

背景技术

免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌，免疫方法的优点是样品在进行选择性增菌后，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选，由于免疫法有较高灵敏度，样品经增菌后可在较短的时间内达到检出度，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成，此技术对操作者要求也不高，是目前为止基层单位应用时间最长最为广泛的一项快速检测技术，其中免疫胶体金技术是极灵敏又快速的诊断方法之一。

革兰氏染色法能够把细菌分为两大类：凡被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌；染成红色的称为革兰氏阴性菌。在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全，假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；另外，细菌培养时间太长，已经有部分细菌发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。

脉冲电场(pulsed electric field，PEF)是最近20年来发展起来的横跨生物电磁学、高电压和微电子等领域的新技术，已经被广泛应用。在场强高达kV/cm时，宽度在微秒到毫秒级的脉冲可以使细胞膜的脂质双分子层暂时重新排列，形成微孔，帮助许多平时不能通过细胞膜的亲水性大分子顺利通过；当取消脉冲电场后，微孔会关闭而不会对细胞造成任何影响，这种现象称为电穿孔，该技术通过超短脉冲的穿膜入核特性，避免了高温热效应引起的改变，有效保持了膜抗原的活性，因此达到低温灭活的效果。

目前有关检测革兰氏菌的方法已有诸多报道，其工艺方法主要有便携式革兰氏套装染片（专利申请号：201110226527.2，由浓缩的革兰氏染液、高渗透性滤纸、高吸水性海绵和四联排聚乙烯塑料袋制成）；革兰氏阳性菌的灭活（专利申请号：200680035823.1，所述方法包括暴露于可见光，且特别地在波长400-500nm范围内的光）；可提取革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌核酸的核酸提取芯片（专利申请号：201310296807.X，基于硅珠法提取革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌核酸的核酸提取芯片）；鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法（专利申请号：201310412457.9，利用革兰氏阴性菌特异性表达L-丙氨酸氨基肽酶的性质，采用L-Alanine-AMC-TFA作为该酶的底物，利用环糊精阻滞产生的4-甲基香豆素的扩散，通过在平板上菌落产生的较强荧光区分革兰氏阴性菌和阳性菌）；革兰氏阳性细菌核酸提取方法（专利申请号：201210162646.0，提供一种破除革兰氏阳性细菌的细胞壁的试剂，由提取液A和提取液B组成；将Tris、EDTA、SDS、Tween80、TritonX-100、Brij58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，制得提取液A；所述提取液B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，制得提取液B）。

本发明提供的快速检测革兰氏菌的方法，克服了现有的革兰氏染色法经常出现假阳性和假阴性的检测结果的缺陷，将检测过程缩减到10分钟以内，并且大幅提高了检测的灵敏度和特异性，以满足快速检测革兰氏菌的需要；同时本发明提供的试剂盒，可操作性强，具有广阔的市场销售前景。

发明内容

本发明的目的在于：提供的快速检测革兰氏菌的方法及试剂盒，克服了现有的革兰氏染色法经常出现假阳性和假阴性的检测结果的缺陷。

本发明的目的是这样实现的：一种快速检测革兰氏菌的方法，分步实施；

第一步，革兰氏菌培养：将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923和大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922分别接种于哥伦比亚血培养平板上，置于37℃、培养箱内培养12h后，收集菌落；

第二步，用纳秒脉冲对细菌进行低温灭活处理，提取革兰氏阳性菌磷壁酸抗原和革兰氏阴性菌脂多糖抗原；

第三步，将第二步提取两种抗原及质控血清点在制备好的硝酸纤维膜反应板上；