[发明专利]一种核酸荧光探针及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸荧光探针及其制备方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

核酸是生命的遗传物质，在生命活动中起重要作用。核酸的检测在疾病诊断、环境微生物鉴定、适配体等领域有重要应用。因此，发展核酸的荧光检测探针意义重大。传统的核酸荧光探针有EB、YOYO、TOTO、Sybr Green、DAPI及Hoechst染料，用于双链的DNA的检测，灵敏度很高，但是对于单链DNA，特别是短链单链DNA的检测效果很差。目前对于单链DNA还没有足够灵敏的荧光染料以取代荧光标记或同位素标记的DNA探针，特别是在核酸电泳的应用中，荧光标记或者同位素标记的核酸探针成本高，操作复杂。另外，传统的核酸染料中，以EB为代表的嵌入剂具有强的致癌性；而低致癌性的染料，如Sybr系列等，其合成过程复杂，导致价格昂贵，其应用远不及EB广泛。因而发展低毒的、低成本、合成简单的单链核酸的荧光染料意义重大。

发明内容

本发明要解决的问题在于针对现有技术的不足，提供一类高灵敏度的核酸探针，具体方法是将胺基引入到四苯乙烯分子上；制备了一系列胺类分子。这类分子的合成简单，其检测核酸分子的原理是：中心核四苯乙烯为荧光分子，其在溶液中游离时，分子内的单键自由旋转导致激发态能量以热的方式消耗，因而不发光；而将胺基共价连接到四苯乙烯上后，不论胺基连接在什么位置，不论连接的胺基数量是多少，胺基都可以与核酸结合，从而使四苯乙烯分子锚定在核酸上，限制分子内的旋转，因而激发态以辐射方式跃迁到基态，即荧光增强。由于胺基质子化后，主要以静电力和氢键的协同作用结合核酸上的磷酸，也可以以氢键结合核酸上的碱基，因而这类化合物无论对单链还是双链核酸都有高灵敏度的检测效果。

本发明所提供的核酸荧光探针为胺类化合物，这类化合物的结构通式如下所示：

其中R^a、R^b、R^c、R^d结构式为

其中R^e、R^f、R^g、R^h、Rⁱ彼此独立选自H、OH、F、Cl、Br、I、C_1-20烷基、C_1-20烷氧基、C_1-20烷基取代的氨基、C_1-20烷基取代的苯基、C_1-20烷基取代的萘基、(CH₂CH₂O)_mCH₃、(CH₂CH₂O)_mH、(CH₂CH₂NH)_mH，m为0-6的整数；L为其中，n为1-20的整数；R^j、R^k独立选自H、C_1-20烷基、C_1-20烷基取代的苯基、C_1-20烷基取代的萘基、(CH₂CH₂O)_pCH₃、(CH₂CH₂O)_pH、(CH₂CH₂NH)_pH，p为0-6的整数。

R^a、R^b、R^c、R^d的结构彼此独立但至少其中一个含有

上述探针的制备原料是含有－Br的四苯乙烯化合物，通过反应将－Br转化成胺基。这些四苯乙烯类化合物为已知化合物，或者用本领域已知的方法合成。具体是通过McMurry反应合成，参考文献有：Chem.Commun.2006,3705–3707；Chem.Eur.J.2008,14,6428–6437；Org.Lett.2008,10,4581–4584；Adv.Funct.Mater.2009,19,1891–1900；Chem.Eur.J.2010,16,1232-1245；Tetrahedron Letters,2010,51,1960–1962；J.Mater.Chem.2012,22,232-240；J.Am.Chem.Soc.2013,135,62-65等。

根据探针的不同结构，由含有－Br的四苯乙烯化合物制备探针分下述两类方法合成：