[发明专利]一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法

说明书

技术领域

本发明属于抗生素分离提取领域，涉及一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法。

背景技术

埃博霉素B(epothilone B)是一类大环内酯类化合物，分子式为C₂₇H₄₁NO₆S，相对分子量为506.25，熔点为93℃-94℃，具有多种生物活性，可以作为抗生素药物，由德国国家生物技术中心(GBF)的G.等人于1993年首次报道。

不久以后，Merck实验室在对7000种天然提取产物筛选紫杉醇类似物实验中，再次发现了埃博霉素。并且发现它具有与紫杉醇相同的作用机制，可以促进GTP(三磷酸鸟苷)依赖性微管蛋白聚合形成微管，并且对微管有稳定作用。证明了埃博霉素对肿瘤细胞有抑制作用的这个事实。进一步研究发现，埃博霉素具有比紫杉醇优越的抗肿瘤特性。①埃博霉素比紫杉醇水溶性好，结构简单，有利于化学合成埃博霉素及结构衍生化。②埃搏霉素没有紫杉醇细胞内毒素活性。③与紫杉醇不同，埃博霉素在P糖蛋白表达型的多药耐药性细胞中也维持很大的细胞毒性。④在Richard等研究的紫杉醇敏感的人类细胞系中，埃博霉素B比埃博霉素A和紫杉醇具有更大的抗增殖活性。所以，此抗癌药物可能成为紫杉醇更新换代的新产品，对其开发研究具有重要的意义。

目前已有一些对埃博霉素B分离提取报道的相关文献，如中国专利CN201310143836.2公开了一种发酵法制取埃博霉素B的方法，中国专利CN200610091035.6公开了埃博霉素B的制备方法和用途，等等。但都存在着一定的缺陷：其中用到的葡聚糖凝胶色谱（LH-20）等需要装柱，平衡，上样，洗脱等注意事项，步骤过于繁琐，使得操作的效率较低而过程费用较高，分离一次需要较长的时间，产物的得率较低。

随着生化分离技术的进步，各种先进的设备和工艺在生产中发挥越来越大的作用，特别是膜技术的发展和应用，使各种生化分离工艺大为改观。膜过滤技术用于发酵产品的分离精制已有成功的先例。但是利用膜分离技术分离提取埃博霉素B的方法，经检索还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于膜过滤技术的埃博霉素B分离提取方法，该方法具有条件温和，操作简便，分离步骤少，选择性好的特点，克服了现有技术存在的步骤繁琐，收率不高等缺陷，并且使制得的埃博霉素B具有较高的纯度。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

（1）树脂对发酵液进行吸附：将纤维堆囊菌在液体培养基中进行发酵，并向液体培养基中加入经过处理的大孔树脂，发酵120-150h后过滤得到吸附树脂，然后用蒸馏水清洗除去吸附树脂表面粘附的菌体；其中，大孔树脂的加入量为液体培养基体积的2-5%；

（2）乙酸乙酯浸提：用乙酸乙酯浸提步骤（1）中经过蒸馏水清洗的吸附树脂，收集浸提液；

（3）用超滤膜过滤浸提液：将浸提液采用截留分子量为1000-5000的超滤膜过滤，去除大分子杂质得到粗提物；再将粗提物进行浓缩，得到浓缩液A；

（4）使用制备型HPLC检测：将浓缩液A进行离心，收集上清液，再用HPLC检测并合并埃博霉素B组分；

（5）结晶：将埃博霉素B组分进行真空浓缩，得到浓缩液B，将浓缩液B于-20～-10℃下进行低温结晶，得到白色粉末状结晶，即为埃博霉素B。

所述步骤（1）中纤维堆囊菌菌株号为ATCC25532或ATCC25569。

所述步骤（1）中大孔树脂为XAD-16型大孔树脂，并且采用如下方法进行处理：首先，用3～5倍大孔树脂体积的甲醇浸泡大孔树脂，摇床震荡12h-16h后，除去甲醇，水洗至无甲醇味；再用甲醇浸泡12h-16h后，除去甲醇并水洗至无甲醇味。

所述步骤（1）中液体培养基成分为土豆淀粉2.5～3.0g/L，蔗糖0.7～1.0g/L，葡萄糖0.2～0.5g/L，豆饼粉1.7～2.0g/L，MgSO₄·7H₂O2.3～2.5g/L，CaCl₂3.0～3.5g/L，EDTA-Fe³⁺2mL/L，微量元素0.5～1.0mL/L，pH值为7.2。

所述步骤（2）中乙酸乙酯的用量为大孔树脂体积的3～5倍，浸提的时间为24-48h。

所述步骤（3）中超滤膜的材质为聚砜、聚丙烯腈或聚酰胺。