[发明专利]一种肿瘤细胞药敏动态测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物敏感性检测技术领域，尤其是一种肿瘤细胞药敏动态测定方法。 

背景技术

癌症严重威胁着人类的健康和生命，每年约新增800万癌症患者，600多万人死于癌症，几乎每6秒钟就有一名癌症患者死亡。在恶性肿瘤的疗法中，药物治疗占有重要地位。由于现有的化疗药物副作用大，易产生耐药现象，因此，寻找更为有效、低毒的抗肿瘤药物仍是当前及今后一段时期内肿瘤治疗的热点。

随着抗肿瘤药物体外敏感性试验深入的研究，目前已发展了不少新的测试方法，如MTT法、[3H] TdR法、⁵¹Cr释放法、LDH法、XTT法、MTS法、CCK-8试剂盒等，但这些方法在评价抗肿瘤药物作用细胞的最佳作用时间时方面受到限制，如：[3H] TdR法、⁵¹Cr释放法具有放射性，操作繁琐。后三种方法是类似MTT法原理的一种终点检测法，只适于检测药物的终点作用效果，而不能动态测试抗肿瘤药物的作用最适浓度和最佳时间。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种肿瘤细胞药敏动态测定方法，它能同时快速、灵敏的测试抗肿瘤药物作用最适浓度和最佳时间，以克服现有技术的不足。

本发明是这样实现的：肿瘤细胞药敏动态测定方法，包括以下步骤：（1）取对数生长期的肿瘤细胞计数，并制备细胞悬液，接种至细胞培养板；（2）向细胞培养板的对应孔中加入抗肿瘤药物，每种抗肿瘤药物设置四个浓度梯度，五个重复；（3）将细胞培养板置于CO₂培养箱中培养48h后，每孔加入刃天青溶液，继续培养，并在培养过程的不同时间段内测量荧光强度值；（4）将测量的荧光强度值带入公式（1）计算药物对细胞增殖抑制率；计算比较，求得药敏数值，判断最适浓度和最佳时间；

公式（1）中，FLU表示荧光强度值。

步骤（1）中，细胞接种量为1×10⁵个/孔。

步骤（3）中，加入的刃天青溶液的浓度为75??g/mL；加入刃天青溶液后的反应作用时间为72h。

所述细胞培养板为96孔板。

步骤（4）中，荧光强度值测定激发波长为571.02nm，发射波长为583.97nm。

所述肿瘤细胞为人慢性髓系白血病细胞K562。

刃天青是一种氧化还原指示剂，活细胞中的乳酸脱氢酶经过一偶联的酶促反应将刃天青转化为试卤灵，显粉红色并产生强荧光信号，试卤灵可被活细胞进一步还原为二氢试卤灵，呈无色并且无荧光信号。刃天青法因操作方便、快捷，常被用于检测牛奶中的细菌污、抗菌药物的抑菌活性、测定细胞毒性等，但鲜有研究报道刃天青法用于抗肿瘤药物的活性测定，因此，应用刃天青法同时快速、灵敏的测试抗肿瘤药物作用最适浓度和最佳时间，具有广泛的应用前景。

为了确保本发明含量测定方法科学、合理、可行，特进行以下实验：

一、供试材料

人慢性髓系白血病细胞K562，由天然产物生化所提供；丝裂霉素（MMC）、顺铂（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、刃天青、MTT，均购自Sigma公司；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；HEPES购自北京鼎国昌盛生物公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司）。

二、试剂的准备

刃天青用双蒸水配成浓度5000??g/mL的原液，MTT用 pH6.8 的磷酸缓冲液（PBS）溶解成 5mg/mL 的贮存液，过滤除菌，分装置于4℃避光保存。

三、细胞悬液的制备

    取对数生长期的细胞用血细胞计数板计数，调整细胞浓度为5×10⁵个/mL，备用。

四、刃天青法的条件优化