[发明专利]百脉根特异性表达H5N1抗原蛋白的三价HA-2HA1-LTB融合表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及百脉根特异性表达H5N1抗原蛋白的三价HA-2HA1-LTB融合表达载体。 

背景技术

H5N1高致病性禽流感病毒的不断变异和可通过侯鸟迁徙传播等特性，给传统疫苗的研制及免疫途径带来了极大的困难。禽流感病毒具有极高的突变和重组频率，加之其高毒性和潜在感染人的能力，使得禽流感的防控成为一个世界性难题。不断蔓延的疫情给我们再一次敲响了警钟，被动地根据发病病毒亚型进行治疗往往具有滞后性和盲目性，且禽流感病毒具有宿主多样化和随候鸟迁徙等特点，只有建立成熟的疫苗生产平台，研制可广谱免疫中和多种亚型禽流感病毒的植物可饲疫苗，通过在候鸟迁徙地投放，才能从根本上控制甚至消灭禽流感病毒。 

禽流感毒株A/Hong Kong/156/97(H5N1)血凝素基因（HA）序列（Genebank No.AF028709.1）、蛋白序列（AAC40508.1），A/common magpie/Hong Kong/5052/2007(H5N1)血凝素基因（HA）序列（Genebank No.CY036173.1）、蛋白序列（ACJ26242.1），A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)血凝素基因（HA）（Genebank No.DQ914814.3）、蛋白序列（ABK34764.2）。此3株禽流感血凝素（HA）抗原蛋白包含所有H5HA蛋白的抗原表位，血凝素参与病毒与受体结合、细胞膜融合及进入细胞全过程，是流感病毒表面重要的糖蛋白。大肠杆菌热敏毒素B亚基基因（LT-B）序列（Genebank No.M17873.1）、蛋白序列（AAA98065.1）均来自Genbank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）大肠杆菌热敏毒素B亚基（LTB）能刺激肠道上皮细胞，蹭墙黏膜细胞对抗原通透性，从而增强免疫反应，具有高活性、无毒性的特点。 

利用全价饲料豆科牧草——百脉根（Lotus corniculatus）作为植物生物反应器生产广谱（可免疫中和所有H5亚型禽流感病毒）禽流感转基因植物可饲用疫苗，是解决这一难题的最有效的途径。通过基因工程技术手段实现抗原蛋白在百脉根中的高水平表达，并在候鸟迁徙地投放转基因植物疫苗，不仅可节省下游纯化的成本，生产低成本的疫苗，更重要的是能够切断禽流感传播途径，实现根本上防控禽流感的 目的。 

发明内容

本发明的目的是提供百脉根特异性表达H5N1抗原蛋白的三价HA-2HA1-LTB融合植物表达载体。 

根据本发明的三价HA-2HA1-LTB融合植物表达载体，其特征在于，在百脉根植物表达载体的多克隆位点，由2E+35启动子至poly(A)-Nos终止子方向，正向依次插入核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的优化HK97HA基因、核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示的优化HK07HA1基因、核苷酸序列如SEQ ID No.6的优化SX06HA1基因和核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的优化免疫佐剂LTB基因。 

根据本发明的三价HA‐2HA1‐LTB融合植物表达载体，其中所述百脉根植物表达载体为pCAMBIA2301。 

本发明分析H5HA蛋白抗原表位多态性，依据主要抗原位点氨基酸差异、宿主、病毒致病性强弱，选取包含所有突变抗原表位的三株H5N1高致病性禽流感毒株即：HK97HA-A/Hong Kong/156/97（H5N1）、HK07HA1-A/common magpie/Hong Kong/5052/2007（H5N1）和SX06HA1-A/chicken/Shanxi/2/2006（H5N1），以其HA为目的抗原蛋白，构建三价HA-2HA1-LTB融合蛋白，并利用多种生物信息学软件对融合蛋白的理化性质、二级结构及三级结构进行预测，结果显示融合蛋白结构稳定、构象合理，具备了通过构建植物融合表达载体，实现在植物中稳定表达的基本条件。 

为进一步提高外源蛋白的表达水平，对目的抗原蛋白基因进行修饰改造。分别对HK97HA、HK07HA1、SX06HA1和免疫佐剂LTB基因进行密码子优化，同时对各目的基因起始密码子上游序列进行改造，修饰后基因进行全序列合成。