[发明专利]菘蓝松脂醇还原酶蛋白编码序列及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种核苷酸序列及其应用，本发明还涉及一种蛋白质的序列，属于生物技术领域。

背景技术

菘蓝为十字花科植物，其根入药，即为常用中药板蓝根，有清热解毒，凉血利咽等功效，应用十分广泛，主要制剂有板蓝根颗粒、板蓝根含片等，临床用于流行性感冒、流行性乙型脑炎、流行性腮腺炎、急慢性肝炎、带状疱疹等。化学成分及药理活性研究表明落叶松脂素是菘蓝发挥抗病毒功效的重要活性物质基础。因此，提高落叶松脂素的含量是获得抗病毒活性高的优良菘蓝品系的关键，具有重要的应用价值。

植物次生代谢工程是利用基因工程和分子生物学方法阐明植物次生代谢产物生物合成的机制，了解清楚代谢途径和相关酶的信息，对控制生物合成路径的基因进行调控，从而达到在分子水平上改造代谢途径，促进目标产物的定向合成，提高植物中特定化合物产量的目的。经文献检索发现，位于落叶松脂素合成途径最后一个步骤的松脂醇还原酶（PLR）对落叶松脂素的生物合成起到了非常重要的调控作用，是木脂素代谢工程的重要靶点。因此，从菘蓝中分离获得松脂醇还原酶并利用其进行代谢调控，将打破落叶松脂素生物合成限速瓶颈，获得落叶松脂素高产的高品质菘蓝株系。目前尚未发现与本发明所提及的菘蓝松脂醇还原酶蛋白及应用的相关报道。

发明内容

本发明提供一种编码具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白的核苷酸序列，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

另外，本发明还提供一种具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白氨基酸序列，其特征在于：其序列如SEQ ID NO.2所示。

另外，本发明还提供一种编码具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白的核苷酸序列在增强植物表达菘蓝松脂醇还原酶中的应用。

另外，本发明还具有这样的特征：采用发根农杆菌C58C1作为转化载体。

另外，本发明还提供了一种以菘蓝总RNA为模板克隆核苷序列所需的引物，其特征在于：

以寡核苷酸R1:5'-ATGAGAGAGAATAATAGCGG-3'为正向引物，以寡核苷酸R2：5'-CTAGAGGAATATTTTCAAATA-3'为反向引物。

另外，本发明还提供了一种通过转菘蓝松脂醇还原酶编码基因提高落叶松脂素的含量的应用。

发明作用与效果

本发明提供了一种具有编码具有菘蓝松脂醇还原酶活性的蛋白的核苷酸序列，以及相应的氨基酸序列，并且提供了核苷酸序列在提高菘蓝中落叶松脂素的含量中的应用，具有重要的实用价值。

附图说明

图1是IiPLR和拟南芥PLR蛋白的比对；

图2是IiPLR重组蛋白在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中原核表达的SDS-PAGE电泳图；

图3是IiPLR转基因发根的分子检测图；

图4是IiPLR转基因菘蓝发根中IiPLR表达的RT-PCR分析图；以及

图5是IiPLR转基因菘蓝发根中落叶松脂素的含量图。

具体实施方式

以下结合附图描述本发明实施例的具体实施方式

<实施例一>菘蓝松脂醇还原酶基因的克隆

1.组织分离

菘蓝（I.indigotica）叶片采集自第二军医大学药学院植物园，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。

2.mRNA的分离

取部分组织，用研钵研碎，加入盛有加入盛有TRIzol裂解液(TRIzol Reagents,Gibco,NY,USA)的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。

3.基因的全长克隆

根据已报导的其它植物中松脂醇还原酶保守序列，设计简并引物，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法（即通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术），使用商品化的Gibco BRL试剂盒。

进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：

(1)3'-RACE