[发明专利]稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及利用专用引物及相应酶切方案检测稻瘟病菌中的无毒基因。 

背景技术

由真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病，是世界水稻生产中的首要病害。稻瘟病菌与水稻寄主之间的互作符合Flor的“基因对基因学说”，即若稻瘟病菌具有无毒基因，而水稻品种携带相应的抗病基因，水稻就会对稻瘟病菌产生抗性。无毒基因是寄主与病原物互作中能够改变寄主细胞状态的一类重要病原物基因---激发子的重要成员。寄主植物中每一个显性的抗性基因，在病原真菌中对应存在一个显性的无毒基因；寄主的抗病基因产物以直接或间接的方式对病原菌的无毒基因产物进行识别启动防卫反应，进而产生对该病原菌的抗性。只有寄主植物中存在相应的抗病基因，而病菌中又存在相应的无毒基因，植株才能表现出抗病性，继而引发病原菌与寄主植物的非亲和反应，促使局部细胞发生过敏性细胞坏死，以阻止病原微生物在植株体内的扩展[Liu JL et al.，2010]。鉴定稻瘟病菌的无毒基因，有助于人们根据不同地区流行菌株的无毒基因型选择具有相应抗病基因的水稻品种进行合理布局，同时育种家可根据田间主要流行菌株所携带的无毒基因利用分子标记辅助手段选育具有相应抗病基因的水稻品种进行栽培和推广，从而减少农药的使用和稻瘟病对水稻生产造成的威胁。 

稻瘟病抗性基因Pik位于水稻11染色体长臂，对许多中国稻瘟病小种有较强的、稳定的抗性[Fjellstrom et al.，2004]，该基因具有4个等位基因，分别为pik-p，pik-m，pik-s及pik-h。稻瘟病菌无毒基因AVR-pik于2009年被克隆[Yoshida K et al.，2009]，目前已知5种等位基因类型，分别为AVR-pik-A，AVR-pik-B，AVR-pik-C，AVR-pik-D，AVR-pik-E，其中AVR-pik-D为该基因进化之初最先发现的类型，可为pik／pik-p／pik-m所识别，而其它几种类型为该基因在与水稻品种抗病基因共同进化中陆续出现的突变型[Hiroyuki Kanzaki et al.，2012]。这些无毒基因可为pik抗病等位基因识别的范围相对于AVR-pik-D类型小一些，如AVR-pik-B仅可与抗病基因pikm和pikp间发生非亲合反应(不发病)，因此准确鉴定这种类型的等位基因，用以检测田间流行稻瘟病菌株的特异性，可有助于人们根据水稻品种所携带的抗病基因进行合理布局，减轻稻瘟病的危害。 

发明内容

为准确鉴定稻瘟病菌所携带的无毒基因，进而有针对性选育及推广具有相应抗稻瘟病基因的水稻品种，减轻稻瘟病的危害，本发明提供了一种用于检测稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B的方法，可以用于稻瘟病菌所携带无毒基因的检测，以为品种布局及抗病品种选育提供参考。 

本发明提供如下解决方案： 

一种用于检测稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B是否存在的引物对DNA，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。 

本发明进一步提供SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对在检测稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B上的用途。 

一种检测稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B是否存在的方法，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列为引物，扩增待检测DNA，若扩增出503bp大小的特异性片段且扩增子含有如SEQ ID NO：3所示序列即为含有无毒基因AVR-pik-B。 

一种区分稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B与其它等位基因的方法，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列为引物，PCR扩增待检测DNA，获503bp的扩增产物，进一步以NlaIII酶消化，若PCR产物不能为NlaIII酶消化，则待检测DNA中存在无毒基因AVR-pik-B；若PCR产物酶切后可获367bp和136bp两个DNA片段，则表明待检测DNA中存在稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B的等位基因AVR-pik-A、AVR-pik-C、AVR-pik-D或AVR-pik-E。 

上述引物及酶切方法对优选稻瘟病菌丝所提取的DNA进行鉴定，检测是否携带稻瘟病菌无毒基因AVR-pik-B，检测方便，准确率高，可为稻瘟病抗病育种及品种布局提供参考。 

附图说明

图1是以稻瘟病菌DNA为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列为引物扩增产物经NlaIII酶消化后的凝胶电泳图；