[发明专利]一种菹草的组织培养方法

说明书

技术领域

本发明属于一种菹草的组织培养方法技术领域。

背景技术

与陆生植物相比，水生植物极易污染，菹草作为一种水生植物，其离体培养过程中外植体表面灭菌和尔后内生菌抑制的难度都较其它植物高，实验每一环节都有可能出现污染。灭菌剂的种类选择、浓度配比以及操作程序的设定都是灭菌成败的关键。灭菌强度过大、时间过长，植物会全部死亡；灭菌不足，会全部污染。这两大技术难点往往成为水生植物组织培养的瓶颈。

虽然近年来已有一些针对菹草组培方法的研究，但是该植物特异性较强，培养条件难以统一。

发明内容

本发明通过多种实验设计，本实验获得了一套适宜的培养方法。本发明采用如下技术方案实现。

一种菹草的组织培养方法，该方法步骤为，从沉水植物菹草上剪取带节茎段，在自来水中浸泡后剪去叶片，用去离子水冲洗；在超净工作台内灭菌，然后把茎段剪成1cm左右的小段，且每一段上须含一个茎节，得到组培的外植体；最后，转接到底部有MIII固体培养基的玻璃瓶中培养；将玻璃瓶置于无菌培养室，条件：温度为25±1℃，光暗比12h：12h，培养直到生根；在超净工作台内将生根的外植体从固体培养基上转接到无菌的MIII液体培养基中，继续置于无菌培养室，条件：25±1℃，光暗比12h：12h，培养成为长势健康的幼苗。

本发明方法具体的步骤为，从沉水植物菹草上剪取嫩尖部分的带节茎段，长约10cm，在自来水中浸泡1小时，剪去叶片，用去离子水冲洗3遍；在超净工作台内灭菌，然后把茎段剪成1cm左右的小段，且每一段上须含一个茎节，得到组培的外植体；最后，转接到底部有MIII固体培养基的玻璃瓶中培养；置于无菌培养室，条件：25±1℃，光暗比12h：12h，培养直到生根；在超净工作台内将生根的外植体从固体培养基上转接到无菌的MIII液体培养基中，继续置于无菌培养室，条件：25±1℃，光暗比12h：12h，培养成为长势健康的幼苗。

本发明MIII液体培养基的配制方法步骤为：以总体积1L计：

1）大量元素称量并根据顺序先后溶解于一定量的纯水中，大量元素包括：0.0848gNa₂SiO₃.5H₂O，0.0425g NaNO₃，0.0068g KH₂PO₄，0.086g CaSO₄·2H₂O，0.00745g KCl，0.0735gCaCl₂·2H₂O，0.0615g MgSO₄·7H₂O；

2）加入少许1N的盐酸溶液，搅拌使物质溶解（可用微波加热或超声波处理助溶）；

3）加入1ml的100倍微量元素母液；微量元素母液的配方为：取30.8g H₃BO₄，12.08gMnSO₄.4H₂O，2.209g ZnSO₄.7H₂O，0.968g Na₂MoO4.2H₂O，1g CuSO₄.5H₂O，3.792gAlK(SO₄)₂.12H₂O，0.952g CoCl₂.6H₂O，1.124g NiSO₄.7H₂O，0.952g KBr，0.664g KI，0.774gH₂SeO₃，溶解于水，定容至100ml;

4）加入10ml Fe-EDTA溶液（需预先配制FeCl₃贮备液：将2.7g FeCl₃.6H2O和10ml0.1N HCl溶解于蒸馏水中，最终定容至100ml，得到FeCl₃贮备液；然后配制Fe-EDTA溶液：将0.372gNa₂EDTA.2H2O溶于大约400ml蒸馏水中，加入5ml上述FeCl₃贮备液，用高压灭菌锅灭菌，取出冷却至室温后在无菌条件下用无菌蒸馏水定容至500ml）；

5）定容至1L，调整pH为6.0；

6）高温高压灭菌，取出冷却至室温后使用，或直接置于冰箱冷藏，每次使用前要恢复至室温。