[发明专利]一株重组大肠杆菌及其在制备抗O157:H7的N-糖蛋白疫苗中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株重组大肠杆菌及构建方法以及该重组菌株在生产抗大肠杆菌O157:H7N-糖蛋白疫苗中的应用。属于生物技术、基因工程和微生物发酵领域。

背景技术

肠出血性大肠杆菌O157:H7在临床感染中常常引起血样腹泻、贫血和肾衰竭，常常危及患者生命。我国已分离出大肠杆菌O157∶H7，表明我国也有该病爆发流行的潜在危险性，应引起足够重视。我国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一,仅次于艾滋病病毒(HIV)，排列第二。由于采用抗生素疗法能够导致大肠杆菌O157:H7的细胞壁溶解，促进细胞毒素的释放，从而加重病程。目前在临床中针对大肠杆菌O157:H7感染的治疗以预防和保守疗法为主。

糖蛋白疫苗被认为是最有效和最安全的抗病原菌疫苗之一，具有广阔应用前景。糖蛋白疫苗通过将细菌多糖如O抗原或荚膜多糖连接到具有免疫原性的载体蛋白上，此糖蛋白能引发依赖于T细胞的免疫应答，可以给予儿童以抵抗细菌感染并且也可以给成年人提供长时间持续的免疫应答。

目前，合成糖蛋白疫苗的方法主要是化学法。即通过基因工程技术表达和纯化载体蛋白，然后同提纯的病原菌表面多糖进行化学耦联。但是由于糖链化学激活的随机性，交联产生的糖蛋白具有高度不均一性；同时，此方法还存在着步骤繁杂、操作困难等问题。基于此，急待建立和开发新的可以大幅降低生产成本的糖蛋白疫苗生产方法。

发明内容

针对现有方法的不足，本发明要解决的问题是提供一株重组大肠杆菌及其在制备抗O157:H7的N-糖蛋白疫苗中的应用。

本发明的技术方案基于空肠弯曲菌N-连接糖基化途径同大肠杆菌脂多糖合成途径相似的特点，采用在大肠杆菌中表达来源于大肠杆菌中的rfb基因簇（O157:H7rfb基因簇：GI:3435170），并过量表达来源于大肠杆菌中的malE基因（来源NEB公司的质粒pMAL-p5X）突变体和来源于空肠弯曲菌的pglB基因（PglB NCBI-GeneID:905417），在改良TB培养基中发酵生产抗O157:H7的N-糖蛋白。

本发明所述的重组大肠杆菌命名为重组大肠杆菌CBEB，其特征在于：所述重组大肠杆菌由如下方法制得：构建含malE^M和pglB基因的共表达载体p-pglB-malE^M，再构建含rfb基因簇的表达载体p-rfb，然后将上述构建的重组质粒p-pglB-malE^M和p-rfb共转化大肠杆菌CLM24中，得到能同时表达pglB、malE^M基因和rfb基因簇的重组大肠杆菌CBEB，其基因型是W3110Δwaal/p-pglB-malE^M+p-rfb；

其中，所述malE^M来源于质粒pMAL-p5X，所述pglB基因来源于空肠弯曲杆菌NCTC11168，共表达malE^M和pglB基因的载体为pBAD24；所述rfb基因簇来源于大肠杆菌O157:H7；表达rfb基因簇的载体为pYES1L；

上述malE^M为malE基因突变体，是通过在malE基因的3’末端插入一段核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的表达糖基化序列的基因所得；

上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌W3110的waal基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为W3110Δwaal，命名为大肠杆菌CLM24。

上述重组大肠杆菌CBEB的构建方法概述：

1.waal基因的敲除

基本方法是通过Red重组系统在大肠杆菌E.coli W3110中敲除基因waal（寡糖基转移酶）。所得缺失waal基因的大肠杆菌E.coli W3110Δwaal命名为CLM24。

上述Red重组系统，是通过质粒pSIM19表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Exo，通过设计带有同源臂的引物扩增带有筛选标记的kan（卡那霉素抗性基因）的重组片段。然后通过电穿孔仪电击，将重组片段转入表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Exo的大肠杆菌中，重组片段在重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组，从而将原有的基因置换下来，而抗性基因通过表达FLP内切酶，从基因组上切除掉。

2.rfb基因簇的表达载体的构建

基本方法是以大肠杆菌O157:H7基因组为模板，克隆rfb基因簇，将所获得的rfb基因簇插入到线性质粒pYES1L中，从而获得rfb基因簇的表达载体p-rfb。