[发明专利]斜带石斑鱼抗菌肽LEAP-2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗菌肽LEAP-2前体蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用；还涉及一种LEAP-2成熟肽蛋白及编码该蛋白的基因、含有该基因的载体及其应用。

背景技术

抗菌肽是生物体内产生的一种具有生物活性的天然小分子多肽，在多种生物体中广泛存在，是生物体免疫系统的一个重要组成部分。自从Steiner于 1981年首次在昆虫体内发现抗菌肽的存在以后，到目前为止人们已经在多个物种中发现了上千种抗菌肽。同时，人们也发现了抗菌肽可以作用于G⁺和G^—细菌、真菌、寄生虫甚至病毒，并且不会对正常细胞产生危害以及产生耐药性。

LEAP-2全称为肝脏表达的抗菌肽-2（liver-expressed antimicrobial peptides-2），属于抗菌肽的一种。它是2003年Krause等在人类血液中首次发现的。LEAP-2最初在肝脏中以前体的形式合成，之后被转运到血液中。在此过程中，LEAP-2被修饰和加工形成成熟肽，主要涉及信号肽的切除和二硫键的形成。LEAP-2前体蛋白一般包括100个氨基酸左右，成熟肽一般包括约40个氨基酸。LEAP-2的蛋白结构与其它抗菌肽蛋白结构存在很大不同，其最主要的特点是多肽序列中包含四个半胱氨酸，并且这四个半胱氨酸可以以1-3、2-4的形式形成两个二硫键。再通过氢键的作用，LEAP-2成熟肽最终可以形成β折叠等高级结构。另外，研究发现LEAP-2具有与一般抗菌肽相同的广谱抑菌能力。

石斑鱼类隶属鲈形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)，石斑鱼亚科(Epinephelinae)，石斑鱼属(Epinephelus)，为暖水性礁栖鱼类，广泛分布于印度洋和太平洋的热带、亚热带海域。石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类之一，其肉质鲜美，营养丰富，为餐桌中的上等佳肴，被港澳地区推为我国的四大名鱼之一，深受各地消费者的喜爱，经济价值巨大。但是，当前气候灾害和环境污染导致的高致病率和高死亡率，一直是石斑鱼人工养殖过程中难以解决的问题。市场上还没有一种能够有效增强石斑鱼免疫力或不产生耐药性的饲料添加剂。

酵母是最简单的真核生物，以其作为宿主表达外源蛋白有很大的优势：生长繁殖快，易培养，操作简单；能对表达的外源蛋白进行翻译后加工修饰，如糖基化、乙酰化等；安全性高，无致病性。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能将甲醇作为代谢的唯一碳源和能源。毕赤酵母表达系统有很多优点在科研及生产中广泛应用：使用强的可诱导启动子-AOX1基因启动子；外源基因以单拷贝或多拷贝定点整合入基因组中，遗传稳定性好；重组蛋白以高水平分泌到几乎无蛋白的培养基中，利用表达蛋白的纯化；容易进行高密度发酵，适合于产业化生产。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白的基因。

本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白。

本发明的另一目的在于提供编码上述石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的野生型基因以及经密码子偏好性改造后的基因mLEAP-2。

本发明的另一目的在于提供含有石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白基因或LEAP-2成熟肽蛋白基因的克隆载体或表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种石斑鱼抗菌肽LEAP-2重组前体蛋白及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供石斑鱼LEAP-2前体蛋白和/或LEAP-2成熟肽蛋白的应用。

本发明所采取的技术方案是：

石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。

编码石斑鱼抗菌肽LEAP-2前体蛋白的基因，其含有SEQ ID NO.1第262-561 bp所示的核苷酸序列。

石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。

编码石斑鱼抗菌肽LEAP-2成熟肽蛋白的基因，其为SEQ ID NO.1第421-561 bp所示的核苷酸序列，或者是SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。