[发明专利]一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用有效
| 申请号： | 201410024763.X | 申请日： | 2014-01-20 |
| 公开（公告）号： | CN104789584B | 公开（公告）日： | 2018-06-08 |
| 发明（设计）人： | 彭健;王荣;蒋思文;潘中勉 | 申请（专利权）人： | 华中农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N1/21;C07K19/00;C07K16/12;C07K16/02;A61K39/40;A61P31/04;A61P1/12;C12P21/02;C07K1/113 |
| 代理公司： | 武汉宇晨专利事务所 42001 | 代理人： | 王敏锋 |
| 地址： | 430070 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 大肠杆菌 卵黄抗体 融合蛋白 人源 小鼠肠道 重组蛋白 肠毒素 粘附素 重组质粒转化 粘附素基因 产肠毒素 上皮细胞 体外实验 重组表达 重组质粒 主动免疫 产蛋鸡 抗原性 提纯 菌株 体外 粘附 制备 应用 诱导 蛋白 验证 试验 | ||
【权利要求书】：
1.一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素etpA融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
在NCBI的GenBank中查找序列号为AY920525的基因座，其中etpA位于编码区2718-8021，全长5304bp，目的片段是5'端的1701bp；以人源肠毒素大肠杆菌标准株H10407为试验材料，将PCR扩增后的目的片段连接至表达载体，得到重组质粒pGEX-etpA；
所述重组质粒pGEX-etpA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；
所述PCR扩增中所用引物为：
引物名称 引物序列 酶切位点 etpA-F GGATCCATGAACCGTATATATAAACTGAAG BamhI etpA-R CTCGAGCGACAGATTAACATTCAG XhoI
其中，GGATCC为etpA-F的酶切位点，CTCGAG为etpA-R的酶切位点；
将得到的重组质粒pGEX-etpA转化入大肠杆菌BL21(DE3)，以诱导物异丙基-β-d-硫代半乳糖苷做诱导表达；诱导表达条件为：37℃摇床培养至OD600达到0.5-1.0，加入IPTG至0.1mM，继续培养3-4h，最终表达量均在20％以上，以包涵体的形式存在；将包涵体经压力破碎、变性和复性浓缩后得到的包涵体蛋白etpA融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。
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