[发明专利]一种猪精原干细胞冻存液及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪精原干细胞冻存液及其使用方法，属于干细胞生物工程领域。

背景技术

精原干细胞体外长期培养是近几年才发展起来的技术，而对于精原干细胞，还没有专用的冻存液和冻存方法。多数精原干细胞冻存液是从国外公司购买，如cell freezing medium,（Cat no:C6295,Sigma），周期长、价格昂贵，而且在长距离运输过程中容易变质，产生沉淀，不能有效的冻存精原干细胞。

另外，有专利指出用低密度脂蛋白、海藻糖和卵磷脂按一定比例混合，可以用来冻存精原干细胞（专利号：201110124683.8）。2007年，morteza koruji报道了以DMEM为基础液，添加10%FCS、1.4M DMSO、0.07M蔗糖，冻存小鼠精原干细胞，结果表明解冻后细胞成活率为68%。F Izadyar报道了以MEM为基础液，添加10%FCS、10%DMSO、0.07M蔗糖，冻存牛的精原干细胞，冷冻复苏后精原干细胞的存活率达70%。2013年，Yong An-lee报道以α-MEM为基础液，添加10%FBS、10%DMSO、2.5%聚乙二醇，冻存小鼠精原干细胞，解冻后精原干细胞可正常形成克隆。而上述文章所述的冻存液没有商品化产品，没办法购买，而且没有针对猪精原干细胞的冻存液，所以不一定适合猪精原干细胞的长期冻存，这样就制约了猪精原干细胞的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪精原干细胞冻存液及其使用方法，可以降低实验成本，提高冻存效率。本冻存液中不含血清，为精原干细胞的无血清培养提供了一个可选的冻存液。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种猪精原干细胞冻存液，它由基础液DMEM/F12、BSA（牛血清白蛋白）、DMSO（二甲基亚砜）组成。

优选的是：BSA（牛血清白蛋白）加入量为0.3%～0.6%的DMEM/F12质量。

优选的是：DMSO（二甲基亚砜）加入量为10%的DMEM/F12质量。

一种猪精原干细胞冻存液的使用方法，包括以下步骤：预冷冻存管和冻存液至4℃，收集猪精原干细胞，用冻存液稀释至每毫升含5×10⁴～1×10⁵个猪精原干细胞，每管分装1ml，4℃冷冻10～30min，-80℃冻存24h，投入液氮保存。

本发明配制的冻存液成分简单，成本低，不含血清，用BSA取代血清，为猪精原干细胞的无血清培养提供了一个可靠的保存方法。

本发明的冻存效果好，用此方法冻存的猪精原干细胞，解冻后细胞的存活率可达85%左右，不影响猪精原干细胞克隆的形成，是一种可靠的冻存方法。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

取所需体积的基础液DMEM/F12，加入BSA、DMSO，其中BSA加入量为0.3%的DMEM/F12质量；DMSO加入量为10%的DMEM/F12质量。预冷1.8mL冻存管和配制好的冻存液至4℃，收集猪精原干细胞，用冻存液稀释至每毫升含5×10⁴个猪精原干细胞。每管加1毫升含猪精原干细胞的冻存液，4℃冷冻10min，-80℃冻存24h，投入液氮保存。

实施例2

取所需体积的基础液DMEM/F12，加入BSA、DMSO，其中BSA加入量为0.5%的DMEM/F12质量；DMSO加入量为10%的DMEM/F12质量。预冷2mL冻存管和配制好的冻存液至4℃，收集猪精原干细胞，用冻存液稀释至每毫升含7×10⁴个猪精原干细胞。每管加1毫升含猪精原干细胞的冻存液，4℃冷冻20min，-80℃冻存24h，投入液氮保存。

实施例3

取所需体积的基础液DMEM/F12，加入BSA、DMSO，其中BSA加入量为0.6%的DMEM/F12质量；DMSO加入量为10%的DMEM/F12质量。预冷3mL冻存管和配制好的冻存液至4℃，收集猪精原干细胞，用冻存液稀释至每毫升含1×10⁵个猪精原干细胞。每管加1毫升含猪精原干细胞的冻存液，4℃冷冻30min，-80℃冻存24h，投入液氮保存。