[发明专利]一种新型错配结合蛋白与纤维素结合域3的融合蛋白及其高通量去除DNA合成中错误的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及构建一种能够去除寡核苷酸及DNA中合成错误的融合蛋白MutS及其应用的领域。本发明涉及利用固定化重组错配结合蛋白MutS固定化构建纤维素柱的方法。本发明还涉及MutS纤维素的层析柱对芯片合成寡核苷酸及其组装DNA的合成错误的纠正的方法，特别是利用这种固定重组蛋白的层析柱高效快速的高通量纠正DNA的合成错误的方法。 

背景技术

基因的从头合成技术无论在合成生物学，系统生物学以及普遍的生命科学研究中发挥着越来越重要的作用[1-6]。基因的从头合成普遍采用的策略是使用合成的寡核苷酸作为原材料，再利用各种拼接方法将这些短的寡核苷酸组装成较长的目的基因。然而，这些寡核苷酸合成价格以及合成通量成为了基因从头合成面临的问题。现在，采用传统的DNA合成技术所提供的寡核苷酸(100～200碱基)普遍的价格是0.4～1.0美元/碱基。然而，与传统的DNA合成技术相比较利用微列阵及微流体技术合成的寡核苷酸则需要较低的价格，并且达到更高的通量[7-12]。例如，采用微流体的DNA合成技术可以在一个标准的芯片上同时并行合成百万条不同的寡核苷酸[13,14]。在某些寡核苷酸合成事例中，基于微列阵的DNA芯片合成技术可以提供一百万种60个碱基长度的寡核苷酸库而只需要约600美元的价格[14,15]。 

然而，利用芯片合成的寡核苷酸进行基因的从头合成中还存在多个技术瓶颈。1)与传统技术合成的寡核苷酸相比，芯片合成的每种寡核苷酸的平均数量很低。在一个芯片上，可以一次性合成成千上万种寡核苷酸，但是每种寡核苷酸的数量只有10⁴～10⁶条[12]。2)芯片合成的寡核苷酸库的成 分很复杂。合成的寡核苷酸从芯片上切割下来后会形成一个含有成千上万不同种类寡核苷酸的文库，而当使用这些寡核苷酸进行后续的基因全长的组装时，由于文库中的序列的多样性将给全长基因的组装带来很大的困难。3)芯片合成的寡核苷酸的质量较传统方法合成的寡核苷酸差。当这些寡核苷酸组装成为全长基因的时候(500～5000nt)，由于寡核苷酸本身的合成错误而给组装的全长基因引入大量的突变。幸运的是，芯片合成寡核苷酸较低的产量和复杂的组成可以通过引入通用引物以及高保真PCR技术得到部分的解决。通过向寡核苷酸序列两端加入不同的通用引物，可以将复杂的文库分割为多个成分较为简单的亚文库，然后通过高保真PCR扩增这些目的寡核苷酸亚库从而得到较高量的成分较为简单的亚文库[12]。综上所述，芯片合成寡核苷酸的质量变成了利用芯片合成DNA进行基因从头合成的最主要的障碍。 

提高芯片合成寡核苷酸的质量可以通过提高合成过程中合成循环的效率[16]或者在芯片合成后的进行DNA纠错[8,12,17]。有文献报导的，通过优化试剂流动以减少寡核苷酸合成过程中的脱嘌呤化(depurination)作用，从而有效的降低合成中的副反应(side reactions)，最终提高目标寡核苷酸的合成质量以及产量[16]。高效液相色谱(HPLC)，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术也可以用于提高合成寡核苷酸的质量[15,18]。使用这些方法，约90%的会导致合成寡核苷酸长度变化的合成错误可以被去除。除此以外，一种设计合成两张含有互补序列的芯片，然后通过杂交选择的方法可以将芯片合成寡核苷酸的正确率提高约9倍[12].另外还有文献报道了，一种高并行高通量的寡核苷酸纠错方法，该方法结合高通量的DNA测序技术，设计使用一种高通量的平台特异性的选择那些测序显示序列正确的寡核苷酸，从而提高芯片合成寡核苷酸的质量。通过该方法可以获得正确率提高了约500倍的寡核苷酸[19]。