[发明专利]一种微生物发酵生产利普司他汀的方法及培养基

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种微生物发酵生产利普司他汀的方法，以及所用的发酵培养基。

（二）背景技术

利普司他汀（Lipstatin）是由毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）经发酵产生的代谢产物，其四氢衍生物为奥利司他（olistat）是罗氏公司（Roche）成功开发的减肥药（赛尼可），奥利斯他是第一个胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活，减少脂肪的分解和吸收，从而达到控制体重的作用。奥利斯他是目前唯一的不进入血液、不作用于中枢神经系统的减肥药。

奥利司他可以通过全化学合成法或先通过发酵合成法产生利普司他汀后进行氢化合成。由于全合成法生产成本比较高，目前主要由微生物发酵合成法生产，该法成本较低，环境友好，适合大规模生产。

发酵法生产中，主要通过毒三素链霉菌发酵生产。因此，通过对该菌菌株的改良、培养基以及发酵工艺条件的优化来提高利普司他汀的发酵效价都是研究的目标。国内外有不少利普司他汀发酵生产的相关专利。美国专利US4598089、US2005089978A1描述了利用毒三素链霉菌菌株NRRL 15443进行利普司他汀发酵生产的工艺。欧洲专利EP0803567描述了发酵过程中通过添加亚油酸、辛酸和N-甲酰基-L-亮氨酸或亮氨酸来提高利普司他汀的工艺，但是发酵水平比较低，低于lg/L。国际专利WO 03/048335描述了用油替代具体脂肪酸生产脂肪酸的方法。国际专利W02004003212中描述了利用不同淀粉底物的培养基，发酵水平为1.486g/L。国际专利W003048335发酵水平为1.8g/L。美国最新的美国专利US8501444（2013年8月）描述了亚油酸和ω-9脂肪酸的结合使用，显著提高了利普司他汀的产量。中国专利CN 102268466B描述了通过在发酵过程中流加亚油酸和亮氨酸以及控制发酵工艺提高了利普司他汀发酵效价的方法，其中利用发酵罐生产利普司他汀的效价可以达到5g/L以上。

（三）发明内容

本发明目的是提供了一种通过给该菌的发酵培养基中补加微量元素、补加前体物质来提高来提高利普司他汀发酵单位的方法，尤其是通过补加微量元素和前体物质的组合优化工艺来显著提高利普司他汀产量。

本发明采用的技术方案是：

一种微生物发酵生产利普司他汀的方法，所述方法包括：将毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）接种至发酵培养基，在28℃、220r/min下进行发酵培养，并在发酵培养第4天添加亮氨酸至其终浓度为40～50mmol/L、第6天添加正辛酸至其终浓度为30～40mmol/L，总发酵培养时间为150～180h，发酵结束后，于发酵液中获得所述利普司他汀；所述发酵培养基组成如下：黄豆饼粉30～40g/L，玉米蛋白粉5～10g/L，葵花油80～120g/L，大豆卵磷脂20～30g/L，甘油20～30g/L，吐温-80 0.01～0.1g/L，碳酸钙0.1～1.0g/L，维生素E0.01～0.5g/L，维生素C0.05～0.5g/L，MgSO₄10～15mmol/L，CoSO₄·7H₂O0.5～2.0mmol/L，ZnSO₄·7H₂O0.1～0.5mmol/L，溶剂为水，pH7.0～7.5。所述毒三素链霉菌（Streptomyces toxytricini）菌株为本领域已知可用于生产利普司他汀毒三素链霉菌菌株，可市购或者从菌种库购买获得。

优选的，所述发酵培养基组成如下：黄豆饼粉32.5g/L，玉米蛋白粉8g/L，葵花油100g/L，大豆卵磷脂25g/L，甘油22.5g/L，吐温-80 0.05g/L，碳酸钙0.8g/L，维生素E0.025g/L，维生素C0.125g/L，MgSO₄12mmol/L，CoSO₄·7H₂O1mmol/L，ZnSO₄·7H₂O0.25mmol/L，溶剂为水，pH7.1。

优选的，所述亮氨酸添加量为45.72mmol/L、正辛酸添加量为31.1985mmol/L。

在发酵培养之前，菌株通常需要进行常规种子斜面活化培养和种子扩大培养，具体可如下：