[发明专利]香石竹PS1基因5`侧翼未知序列的克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，是一种利用简并引物和特异引物，通过巢式PCR扩增技术，基于香石竹PS1基因已克隆的部分DNA序列测定其5'侧翼未知序列的方法。 

背景技术

利用2n配子进行有性多倍化，比无性多倍化具有更高的适应性和杂合性，是一种有效的多倍体育种途径。我们研究发现香石竹（Dianthus caryophyllus L）多为二倍体，大多数能产生低频2n配子，纺锤体异常是香石竹2n配子形成的主要原因。在拟南芥研究中PS1基因调控纺缍体的方向，PS1基因突变能产生高频率2n配子。研究香石竹PS1基因有助于揭示2n配子形成的分子遗传学机制，而香石竹PS1基因的序列还未被克隆，这影响了香石竹多倍体育种进程。 

拟南芥PS1基因包含7个外显子和6个内含子，编码1477个氨基酸，我们通过同源克隆的方法克隆了香石竹PS1基因部分DNA片断，然而已克隆的部分DNA片断位于基因的3’端，5’端还有长片断的的序列未被克隆，且香石竹PS1基因表达量很低，通过5’Race技术克隆5’端序列有一定难度。因此，通过DNA序列来克隆PS1侧翼序列是成为首选，香石竹PS1基因由于序列结构的特点，采用Hi-TAILPCR技术未能扩出侧翼序列，因此十分有必要探索新的简单、快速、高效的PS1基因侧翼序列的克隆方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、成本低廉、高效准确PCR扩增方法，能够基于已知PS1基因部分DNA序列测定其5’端侧翼未知序列。 

本发明的主要内容包括：同源比对PS1基因，根据保守序列，设计简并引物；根据已克隆的香石竹PS1基因中间片断，设计特异引物；以香石竹基因组DNA为模板，用简并引物和特异引物进行二轮PCR（巢式PCR）扩增，并对其扩增片段进行测序,验证是否是目的片断。本发明所提供的香石竹PS1基因5'侧翼未知序列的克隆方法，具体技术方案如下： 

1.香石竹PS1基因5'侧翼未知序列的克隆方法，包括以下步骤： 

（一）提取香石竹基因组DNA，采用巢式PCR扩增，以提取的香石竹基因组DNA为模板，分别用A1和B2为引物、A2和B2为引物、A3和B2为引物或A4和B2为引物进行第一轮PCR扩增； 

（二）再以首轮A1和B2为引物的PCR扩增产物为模板，用A2和B1为引物进行第二轮PCR扩增；或以用A2和B2为引物的PCR扩增产物为模板，用A3和B1为引物进行第二轮PCR扩增；或以用A3和B2为引物的PCR扩增产物为模板，用A4和B1为引物进行第二轮PCR扩增；或以A4和B2为引物的PCR扩增产物为模板，用A5和B1为引物进行第二轮PCR扩增；将第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物回收纯化后测序，验证是否是目的片断；所述A1引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述A2引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述A3引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述A4引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，所述A5引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述B1引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，所述B2引物的碱基序列如SEQ ID NO：7所示。 

步骤（一）所述第一轮PCR扩增：反应总体系为25μL，其中10×Ex TaqBuffer2.5μL，25mM MgCl₂1.5μL，2.5mM dNTP2μL，10μM A1、A2、A3或A4引物分别为0.5-2μL，10μM B2引物0.5-2μL，5U/μL Ex Taq0.1-0.2μL，基因组DNA1μL，余量为无菌水；扩增程序为： 

（1）、95℃1min， 

（2）、94℃30s， 

（3）、60℃45s～1min， 

（4）、72℃2min30s～3min， 

（5）、从步骤（2）至步骤（4）共进行10个偱环， 

（6）、94℃30s， 

（7）、25℃2～3min，以0.5℃/s升至72℃， 

（8）、72℃2min30s～3min， 

（9）、94℃30s， 

（10）、58℃45s～1min， 

（11）、72℃2min30s～3min， 

（12）、从步骤（9）至（11）共进行25个偱环， 

（13）、72℃5min， 

（14）、4℃终止；