[发明专利]一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法

权利要求书

1.一种基于多重微滴PCR偶联荧光分光光度法的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，针对待测生物样品分别设计PCR特异性引物，并选择性对特异性引物进行不同荧光基团标记；所述荧光基团的激发光谱与发射光谱的带宽之和大于该荧光基团的斯托克斯位移；

第二步，使用上述已标记荧光基团的特异性引物对在水油乳化剂中对相应的DNA模板进行多重微滴PCR扩增；

第三步，PCR产物分离及纯化；

第四步，用荧光分光度法对微滴PCR产物进行定性、定量、高通量检测分析：用不同的荧光基团标记不同的特异性引物，因而不同的PCR产物被不同荧光基团标记即待测生物样品由不同的荧光识别，用荧光分光度法根据荧光基团的发射波长对待测生物样品进行定性检测；同时，测量荧光的强度，通过标准曲线对待测生物样品进行定量检测；上述微滴PCR扩增过程中在等同的PCR参数下同时进行多重PCR反应，同时检测出至少7种待测生物样品，实现高通量检测。

2.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述待测生物样品和对应的特异性引物对及其标记的荧光基团如下所示：

3.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述水油乳化剂具体配制方法为：25℃下，取200μl微滴如下表所示的PCR水相在1.5分钟内逐滴加入到400μl微滴PCR油相中，混合后形成均匀的水油乳化剂，所述水油乳化剂中微滴的直径为1～8μM，每微升的水油乳化剂包含3×10⁶到1×10⁷个微滴；

微滴PCR水相成分

4.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述微滴PCR油相的成分如下所示：

5.根据权利要求1所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，第四步荧光分光度法中利用荧光分光度计或荧光酶标仪检测微滴PCR产物。

6.根据权利要求1或5所述的生物基因定性、定量、高通量检测方法，其特征在于，所述荧光分光光度法中利用Thermo VarioSkan Flash多功能荧光酶标仪检测微滴PCR产物，此时，第一步中所述荧光基团的斯托克斯位移大于17nm；两个不同的荧光基团的激发波长间隔大于等于10nm，发射波长间隔大于等于24nm。