[发明专利]SD大鼠体外心肌细胞缺血再灌注损伤模型的建立

说明书

技术领域

本发明涉及体外损伤模型建立的方法，具体涉及一种体外心肌细胞缺血再灌注损伤模型的建立。

背景技术

缺血再灌注损伤( ischemic/reperfusion injury，IRI) 是指在阻断冠状动脉一定时间后，缺血的心肌在开放循环再灌注期出现的心脏功能 、代谢及结构上的损伤，是临床上心肌缺血性疾病及心脏外科手术中常见的一种严重病变损伤。据WHO 统计，到2020年急性冠状动脉梗阻性疾病将是世界上的主要致死原因，在不久的将来，IRI将会是一个重大的临床问题，这已引起世界各国学者的广泛关注和研究。

缺血再灌注损伤大多是在动物水平上研究的，然而建立体外心肌细胞缺血再灌注模型对于从细胞水平研究心肌缺血性疾病发病机制及治疗具有重大意义。本发明旨在建立体外心肌缺血再灌注模型，为各种心血管疾病的研究及治疗提供基础。发明内容

本发明的目的是建立SD大鼠体外心肌细胞缺血再灌注模型，用于心血管疾病的研究及治疗。

本发明SD大鼠体外心肌细胞缺血再灌注模型建立的具体方法为：

1）将SD大鼠乳鼠处死后取心脏,对心肌细胞进行原代培养，将细胞放入培养箱中培养。

2）在培养24小时之后更换培养液。

3）在培养3天之后，将细胞用缓冲液洗涤3-4次。

4）加入模拟缺血液。

5）将细胞置于缺氧装置中，通入混合气体。

6）60分钟后停止通入气体并密封继续培养。

7）缺血缺氧24小时之后，更换等体积的含5%血清的模拟再灌注液，培养1小时。

具体实施方式

1．模型建立

1）原代心肌细胞的培养取SD大鼠处死，取心脏，PBS清洗3-4次，去心包膜及心房。将心室部分剪碎至体积1mm³左右的颗粒，加入5ml消化酶，于37℃消化30min，轻轻吹打，静置1min后收集上清液，终止消化，过滤，离心弃上清液，加入4ml培养基吹打均匀制成悬液，接种于培养瓶中。

2）体外心肌细胞缺血再灌注模型的建立  

取原代培养第四天的细胞进行研究。实验分两组：正常组（Control）和缺血再灌注组（I/R）

3）心肌细胞缺血缺氧处理

用 PBS洗涤细胞 2～3次，加入模拟缺血液。将细胞置于缺氧装置中，通入 98% N₂ 、2%CO₂的混合气体，60 min后停止通气并密封，继续培养24h。

4）心肌细胞缺血再灌注

缺血缺氧24小时后，更换等体积的含5%小牛血清的模拟再灌注液，再培养1小时。对照组一直于37℃，5%CO₂培养箱中培养。

2．结果与观察

1）形态观察

用透射电镜观察正常和缺血再灌注后心肌细胞的超微结构。电镜下观察正常心肌细胞可见完整核膜，核仁清晰可见，染色质无凝集，而 I/R 后可见染色质固缩,大多聚集在核膜周围，细胞质膜出现膜泡现象。

2）MTT染色观察细胞活性

将心肌细胞按2×10⁴个细胞/孔接种于96 孔板中，每组设4个复孔，24h后缺血再灌注处理，然后正常组和I/R组细胞每孔加入20μL 5mg/mL MTT继续培养4h后弃培养液,每孔加入100μL DMSO，脱色摇床上摇15min后用自动分析酶标仪(570nm)测每孔的OD值。OD 值大小反映细胞活性高低。与正常组相比,I/R 组心肌细胞活性明显降低，细胞凋亡程度加重。

3）Bcl2、Bax等相关基因的表达。

3.1运用免疫细胞化学方法

取各组心肌细胞爬片，按照 SP系列试剂盒进行 Bcl2，Bax免疫细胞化学染色，采用DAB 试剂盒进行显色。免疫细胞化学结果显示，各组细胞均有棕色颗粒出现，即均表达 Bcl2、Bax，但与正常组相比，I/R 组细胞中Bax蛋白阳性表达率明显升高，而Bcl2蛋白阳性表达率明显下降。

3.2 Western Blot方法检测

正常组与 I/R 组均表达Bcl2、Bax蛋白，但与之相比，I/R 组 Bcl2 蛋白表达明显降低，Bax蛋白表达明显上调。

3.3 流式细胞技术测定心肌细胞凋亡率

流式细胞术结果显示I/R后心室肌细胞凋亡率显著增大。

因此，本发明体外心肌细胞缺血再灌注损伤模型的建立，整个操作过程简单，重复性好。为各种心血管疾病的研究及治疗提供基础。