[发明专利]酵母展示脂肪酶生产乳香富硒蓝莓醋的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及一种利用酵母表面展示脂肪酶使脂肪酯解增香及富硒酵母生产出乳香富硒蓝莓醋的方法。

背景技术

水果醋兼有水果和食醋的营养保健功能，是集营养、保健、食疗等功能为一体的深受消费者喜爱的饮品；而蓝莓被誉为“水果皇后”，近年来也出现了如公布号为CN2475343A的中国专利所公开的具有消除眼睛疲劳、营养皮肤、延缓衰老的蓝莓醋。

硒是人体必需的微量元素，我国有72%地区属缺硒或低硒地区，严重威胁着人们的身体健康，开发具丰富乳香和安全补充有机硒的蓝莓醋饮料可有效缓解这种现象，而脂肪酶酯解脂肪及蓝莓富硒、酵母富硒分别是增香富硒的有效手段。

目前，一方面脂肪酶由于稳定性差、价格偏高，在我国主要依赖进口，而限制了脂肪酶的大规模使用，另一方面在稻米加工过程中，对脂肪酯解成中短链脂肪酸具有特异优势的稻米脂肪酶很难从稻米中分离出来，一直未能实际应用而被当作有害物遭灭酶钝化而被废弃。

近几年，现代生物技术的飞速发展使得脂肪酶的开发利用达到一个新的水平阶段，如博士论文（刘文山.脂肪酶在酿酒酵母中的表面展示研究[D]武汉，华中科技大学，2010）所述，酵母菌表面展示脂肪酶具有可提高脂肪酶的产量，在使用过程中不用分离纯化等优点，但并不能保证所有脂肪酶均能展示成功且具酶活性，也尚未见酵母成功展示稻米脂肪酶及其应用的报道。

发明内容

目前，尚无利用毕赤酵母固定稻米脂肪酶酯解乳脂增香并利用富硒蓝莓和富硒酵母制造乳香富硒蓝莓醋的报道，本发明填补了该项空白。

本发明将一种对脂肪酯解成中短链脂肪酸具有特异优势的稻米脂肪酶DNA序列，综合其它信息进行序列组合设计得序列SEQ NO1（如后附序列表），委托生物公司进行序列合成和多个相关基因工程菌构建，然后通过验证实验，选定了巴斯德毕赤酵母壁蛋白为锚定蛋白展示该稻米脂肪酶，将合成得到的基因克隆在pUC57载体上，进一步亚克隆到pPIC9K载体中，再转化到酵母中在葡萄糖培养基中扩增培养，最后通过检测筛选，将扩增得到的表面展示有稻米脂肪酶的酵母液离心过滤后加入乳脂液中，使其发生酯解反应生成中短链脂肪酸，然后与富硒蓝莓醋混合，在饮料调配和热杀菌过程中进一步生成丰富的乳香并提高饮料的口感，同时又使无机硒通过蓝莓或酵母转化为能被人体安全利用的有机硒。

 

附图说明

图1 为琼脂糖凝胶电泳鉴定图1。

图2 为琼脂糖凝胶电泳鉴定图2。

图3 为本发明生产工艺示意图。

 

实施例1 

一、毕赤酵母展示稻米脂肪酶

1、Rlipase基因合成委托生物公司（本例由南京金斯瑞生物科技有限公司）完成，基因克隆在pUC57载体上（pUC57-Rlipase），DNA序列如SEQ1所示。

2、Rlipase亚克隆到pPIC9K载体中

分别将pUC57-Rlipase和pPIC9K载体进行Eco RI和Not I双酶切， 酶切反应体系分别如下：

pUC57-Rlipase质粒               34 ml

10* buffer                             4 ml

Eco RI                                 1 ml

Not I                                   1 ml

总共40ml体系，

pPIC9K质粒                         6 ml

10* buffer                             2 ml

Eco RI                                 1 ml

Not I                                   1 ml

ddH₂O                               10 ml

总共20 ml体系，

分别混匀后放在37℃水浴锅中反应4 h，之后用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示。

3、采用胶回收试剂盒回收目的基因片断Rlipase和pPIC9K载体片断，分别用20 ml水洗脱，

之后用T4 DNA Ligase进行连接反应，反应体系如下：