[发明专利]一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的食源性致病菌，虽然近年来不断有新型的金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxin，SE）被发现，但肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的中毒占金黄色葡萄球菌食物中毒的95%，葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒以A型居多，D型次之。从生牛乳、生肉及乳酪中分离的金黄色葡萄球菌以产生D型肠毒素为主。

在食品加工过程中，经过热处理可以杀灭金黄色葡萄球菌，然而一旦菌体产生外分泌的肠毒素，那么存在于食物中的肠毒素非常稳定，100℃ 30min不被破坏，摄入人体后可以抵抗肠胃液中蛋白酶的分解，并引起人体的呕吐、腹泻等症状。2011年我国公布速冻面米制品新国标GB19295—2011，金黄色葡萄球菌由原来的不得检出变为限量检出，因此为了杜绝食品中金黄色葡萄球菌活菌数合格而肠毒素超标的情况，肠毒素的快速检测对于保障食品安全具有更加重要的意义。

近年来，ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点越来越多地用于肠毒素的检测，虽然胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，但ELISA比胶体金试纸条具有更好的灵敏度，而且更适合高通量检测，因此ELISA也具有相当广泛的应用价值。

发明内容

(一)要解决的技术问题

  本发明的目的在于提供一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，用于食品中SED的批量、快速检测。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明建立了一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D（SED）的双抗体夹心法，该方法包括对检测方法的优化。

其中，单克隆抗体是采用重组SED经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。

其中，用于配对的抗体是通过优化参数下夹心法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳定性好、灵敏度高的特点。

其中，建立的夹心法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，酶标抗体稀释液，酶标抗体稀释浓度。LOD达到0.006ng/mL，R²为0.992。

本发明方法的检测分析原理是：

酶标板上包被了包被抗体5F2，即CGMCC No.7212，合适的浓度下可以最大限度捕获SED；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体10F1-HRP，即CGMCC No.7213-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色15min。如果样品中SED浓度≥0.02ng/mL，那么样品中SED被包被抗体捕获并与酶标抗体10F1-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性；如果样品中SED浓度＜0.02ng/mL，那么样品中SED不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性。

（1）SED单克隆抗体的制备

     以重组表达的SED（北京军事医学科学院提供）为免疫原，免疫 8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选，共筛选到10个细胞株；

（2）单克隆抗体的配对筛选

将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；标品浓度30ng/mL标品稀释液0.01M、pH7.2 的PBS；酶标抗体稀释800倍使用；在此条件下，实验成功得到了11对P/N值>10的配对；

（3）夹心法的建立

选择检测限最稳定的配对，即以5F2为包被抗体，以10F1作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：

抗体包被浓度：1μg/mL，

包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液，

标品稀释液：0.01M、pH7.2 的PBS，

检测抗体浓度：1μg/mL，

反应时间：包被、封闭37℃，2h；标准品，37℃，1h；检测抗体37℃，1h；显色15min；

优化后SED夹心法，LOD：0.006ng/mL，检测限0.02ng/mL。