[发明专利]培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于细胞培养的组合物，尤其涉及一种培养干细胞的组合物，以无血清方式培养胎盘间充质干细胞。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是干细胞的一种类型，具备干细胞的两个重要特征：很强的自我增殖能力和多分化潜能。MSCs起源于中胚层，理论上讲它可以向中胚层组织分化。人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力（J.Orthop.Res.,1991,641-650；Science,1999,28,143-147）。

最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。

目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每10⁵～10⁶个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。

中国发明专利申请200810061267.6公开了一种胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，将收集自胎盘母体侧蜕膜的组织细胞后，先进行原代细胞的贴壁扩增，再行正、负向免疫分选相结合的方法以纯化胎盘间充质干细胞，获得CD34^-CD105⁺细胞，在无血清体外培养体系中继代扩增培养。

中国发明专利ZL200910117522.9公开了一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法，首先将胎盘、脐带或脂肪组织与磷酸缓冲液按2.5～4∶1的重量比混合放入组织粉碎桶中，粉碎后加入胶原酶混匀，在37℃左右条件下孵育、过滤和加入沉淀剂后，吸取上清液，离心，除去上清液，将浓缩的细胞加入到泛影酸钠-聚蔗糖400^#的液体，再离心，收取中间10-15ml的细胞层，用细胞保养液清洗，将收集的细胞计数合格后即可使用。

中国发明专利申请201110005964.1公开了一种从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法，将获取的新鲜的流产胎盘立即进行放血，采用生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液和母血污染；用生理缓冲液灌注，以去除血细胞和组织碎片；将胎盘小叶剪碎，用胶原酶消化，收集细胞成分，通过贴壁筛选法纯化间充质干细胞。

现有的这些技术方案大都从胎盘中分离干细胞，从而建立胎盘干细胞库，尚有诸多缺点，主要体现在纯度和/或获取的细胞数量等几方面，以致尚难以满足人们的期待。

此外，从组织中提取并获得间充质干细胞之后，对间充质细胞的培养，仍需添加胎牛血清进行贴壁培养，也尚没有适合产业应用的培养基，这在成本以及后续临床试验中增加了成本和风险，需要进一步探索。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基，以无血清方式实现胎盘间充质干细胞体外培养。

本发明的另一个目的在于提供一种以无血清培养基培养胎盘间充质干细胞的方法，以有效地提高胎盘间充质干细胞的体外分离和制取效率。

本发明提供的一种培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基，以DMEM（Dulbeco’s Modified Eagle Medium）培养液为基础，还含有成纤维细胞生长因子受体2（Fibroblast Growth Factor2，FGF-2）、生长激素、胰岛素、转铁蛋白（TF）、谷胱甘肽、骨形态发生蛋白4（Morphogenetic protein-4，BMP-4），以及L-谷氨酰胺、丙酮酸钠（sodium pyruvate）、非必需氨基酸和β-巯基乙醇等。