[发明专利]一种抗猪2型圆环病毒病的重组蛋白亚单位疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种抗猪2型圆环病毒病的亚单位疫苗。

背景技术

猪圆环病毒于1974年首次在猪肾细胞系PK15细胞中发现，并被认为具非致病性。1991年在加拿大猪群中发现称之为断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的病，发现其主要是由一种致病性猪圆环病毒引起，被国际分类学会划分为PCV2，而非致病性的猪圆环病毒划分为PCV1。PCV2属圆环病毒科圆环病毒属，其基因组由一环状单链DNA组成，是迄今发现的最小的一种动物病毒。PCV2含有2个主要阅读框ORF1和ORF2，其中ORF1负责编码与病毒复制相关的蛋白（Rep），而ORF2编码病毒的结构蛋白Cap蛋白。PCV2感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪呼吸疾病综合征（PRDC）、猪皮肤和肾病综合征（PDNS）等多种疾病（总称为猪圆环病毒病，PCVD）。研究表明，该病毒在猪的淋巴系统增殖，可引起免疫细胞凋亡，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降，诱发多种病毒和细菌的混合感染和继发感染,给养猪业造成巨大的经济损失，已引起世界各地广泛重视。

目前防控猪2型圆环病毒病的主要方法是接种疫苗，生产中使用的疫苗主要是PCV2全病毒灭活疫苗、PCV1-PCV2嵌合病毒灭活疫苗以及杆状病毒表达PCV2基因工程疫苗。这些疫苗对防制猪2型圆环病毒病有一定的效果，但该病仍然严重发生和流行，说明仅能产生体液免疫应答能力的灭活疫苗和常规的基因工程亚单位疫苗不能很好地控制猪圆环病毒病。猪2型圆环病毒导致B淋巴细胞和T淋巴细胞的减少甚至缺失而引起免疫抑制，因此仅能产生体液免疫应答的灭活疫苗和亚单位疫苗不能产生理想的免疫效果，研究表明，目前使用的商品疫苗均不能刺激机体产生细胞免疫应答导致防控PCV2感染的效果不理想，因此如何开发出能同时激活体液和细胞免疫应答是PCV2疫苗研究的方向。病原感染宿主引起致病是通过病原与宿主相互作用表现出来的，TLR受体在强毒力病原致病或减毒疫苗产生免疫应答方面起重要作用。鞭毛蛋白，是一种TLR5配体，能显著增强抗原的免疫原性与保护性。研究表明，将西尼罗病毒囊膜蛋白与鞭毛蛋白融合制成疫苗免疫能产生抗病毒攻击的中和抗体与保护性抗体，而单独的亚单位抗原免疫不能产生合适的保护性抗体应答。为此，PCV2的免疫原性蛋白ORF2基因与鞭毛蛋白基因连接，并于杆状病毒中表达，开发出良好免疫效力的新型亚单位疫苗，用于猪圆环病毒病的有效防控具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种高免疫原性且没有安全隐患的抗猪2型圆环病毒病的亚单位疫苗，所述的高免疫原性的亚单位疫苗保护性抗原是鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagellin）和猪2型圆环病毒Cap蛋白的融合蛋白。

本发明的另一个目的是提供上述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagellin）和猪2型圆环病毒Cap蛋白的融合蛋白的制备方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一种融合蛋白，其为猪2型圆环病毒Cap蛋白与消除毒力的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合蛋白。该融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO.2所示，编码上述flagellin+Cap融合蛋白的基因，其核苷酸序列见SEQ ID NO.1，该基因用Flagellin-ORF2表示。

此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞等等。

本发明还进一步提供所述flagellin+Cap融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：