[发明专利]用于检测肺炎支原体的荧光定量PCR引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于病原体检测领域，涉及用于检测肺炎支原体的荧光定量PCR引物及其应用。

背景技术

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是呼吸道感染（包括社区获得性肺炎，CAP）中非常重要的病原体。肺炎支原体肺炎广泛存在于全球范围内，多为散发病例，约3-6年发生一次地区性流行，流行时间可长达1年，流行年份的发病率可以达到非流行年份的数倍，容易在学校、幼儿园及军队等人员比较密集的环境中集中发病。最近的一项包括亚洲地区在内的全球性CAP病原学调查结果显示，肺炎支原体肺炎占CAP的12％，在所有非典型病原体感染所导致的CAP中所占的比例超过了50％。与大多数国外地区相比，我国肺炎支原体肺炎的发病率可能更高。有研究表明，肺炎支原体已经超过了肺炎链球菌，成为成人CAP的首要致病原。

据报道，大于20%的社区获得性肺炎由肺炎支原体（MP）引起。由于肺炎支原体缺乏细胞壁，造成社区常用的β-内酰胺类抗生素对其无效，因此，为避免滥用抗生素，早期诊断尤为重要。间接诊断MP感染的抗体检测方法已广泛应用于临床检测，但是这些方法灵敏度不理想，且存在MP感染后持续阳性的现象。国外早已将PCR诊断技术应用于MP感染的诊断，但由于普通的PCR操作过程中易污染，使得假阳性率较高，临床应用受到限制。

实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，QPCR）是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，1996年由美国Applied Biosystems公司首先推出，荧光定量PCR对PCR产物的检测原理做了很大的改进，它利用荧光染料在激发光的作用下，所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变化，因荧光信号变量和扩增产物量成正比，通过足够灵敏的自动化仪器对荧光的采集和分析，从而实现对起始模板定量及定性的分析。Sybr Green I是一种和DNA结合的荧光染料，在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射荧光信号，从而保证荧光信号的增高与PCR产物的增加完全同步。当进行实时监测时，可检测到DNA聚合酶进行DNA合成阶段荧光信号增加，而在模板变性阶段荧光信号减少。因此，在每一次PCR循环终点，可通过检测荧光来检测扩增DNA的增加量。

此技术除了具有传统PCR的特异性强、灵敏度高、检测时间短等特点外，还具有以下特点：全封闭反应，无需凝胶电泳等PCR后处理，减小对环境的污染；不使用有毒试剂，操作安全；采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确；定量范围宽，可达到10个数量级；仪器在线实时监测，结果直观。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测或辅助检测肺炎支原体的引物对。

本发明所提供的引物对特异于肺炎支原体的16SrRNA基因或ATPase基因。

具体而言，所述引物对为如下引物对1或引物对2或引物对3：

所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对；所述引物对2为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对；所述引物对3为由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对。

进一步，组成所述引物对的两条单链DNA分子的摩尔比为1：1。

制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。

该方法具体可包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装的步骤。

本发明是另一个目的是提供一种用于检测或辅助检测肺炎支原体的试剂盒。

本发明所提供的用于检测或辅助检测肺炎支原体的试剂盒，可为实时荧光定量PCR试剂盒，具体可含有所述引物对和如下物质中的至少一种：dNTP、DNA聚合酶和荧光染料。

在本发明中，所述荧光染料具体为SYBR green。

制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。

该方法具体可包括如下步骤：将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与如下物质中的至少一种包装于同一个试剂盒内：dNTP、DNA聚合酶和荧光染料。

在本发明中，所述荧光染料具体为SYBR green。

所述引物对或所述试剂盒在制备检测或辅助检测肺炎支原体的产品中的应用也属于本发明的保护范围。