[发明专利]一种针对宫颈癌具有免疫原性的蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种针对宫颈癌具有免疫原性的融合蛋白及其应用。

背景技术

宫颈癌居于全球女性癌症发病率的第二位，是重要的公共健康问题。全球每年新发宫颈癌病例约50万，有27.3万人死于宫颈癌，其中约85%死亡病例发生在发展中国家，中国每年新增宫颈癌病例约有13.5万，占全球新发病例的1/3，因此中国也是宫颈癌高发国之一。当前，人乳头瘤病毒（HPV）已被证实是引起宫颈癌的主要病原，至少在99%宫颈癌患者组织内检测到HPV DNA。

依据HPV的致癌危险性，分类为低危型和高危型。高度致癌危险的病毒主要包括HPV16、18、26、31、33、35、45、51、52、56、66等亚型，通常在高度鳞状上皮内病变(CIN2～3)中发现。其中HPV16、18可在绝大多数宫颈癌中发现，并且50%以上的宫颈癌患者由HPV16引起。2008年6月，历时5年的《中国妇女人乳头瘤病毒感染和宫颈癌流行病学调查》结果显示，HPV16和HPV18是导致中国妇女患子宫颈癌的最主要类型。

E7蛋白可以抑制Rb（retinoblastoma gene）的抑癌功能，从而以多种方式扰乱正常细胞周期，引起细胞周期的失控，导致细胞的过度增殖，细胞转化及恶变。E7是维持细胞转化和恶性癌变所必需的，因此E7常作为HPV血清学诊断抗原和宫颈癌治疗性疫苗研究的靶抗原。

单核细胞增生性李斯特菌（Lm）是一种宿主谱广泛的兼性胞内菌。Lm被巨噬细胞和其它吞噬细胞吞噬后，既能存在于吞噬体内，又能定居在细胞胞浆中，使Lm运送的外源抗原可以同时进入MHCⅠ类和MHCⅡ类抗原提呈途径，从而诱导强烈的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞免疫应答。这种独特的胞内生活史，使单增李斯特菌成为研究宿主和细菌相互作用及宿主免疫应答的模式细菌，尤其诱导强烈的CD8⁺T细胞免疫应答，其作为传染性疾病和肿瘤疾病疫苗载体具有广阔应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有宫颈癌免疫原性的融合蛋白及其应用。

本发明一方面提供了一种密码子优化的HPV16E7蛋白。

所述密码子优化的HPV16E7蛋白的氨基酸序列如SEQID.1所示：编码HPV16E7蛋白的基因序列为李斯特菌密码子偏好的基因序列，如SEQ ID.6所示。

本发明还公开了一种含有所述HPV16E7蛋白的融合蛋白

进一步的，所述融合蛋白为单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO与密码子优化的HPV16E7的融合蛋白。

所述单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的氨基酸序列如SEQ ID.2所示：

所述融合蛋白中，密码子优化的HPV16E7蛋白插入于前述单核细胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的第37位和第38位氨基酸残基之间，其氨基酸序列如SEQ ID.3所示。

所述融合蛋白针对宫颈癌具有较强的免疫原性。

本发明第二方面提供了一种多核苷酸，其编码所述融合蛋白。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

本发明第三方面提供了一种载体，其含有所述多核苷酸。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述载体。这些方法包括重组DNA技术、DNA合成技术等。可将编码所述融合蛋白的DNA有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mRNA合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。

较佳的，所述载体为原核载体或穿梭质粒，如原核载体pMD-20T、穿梭质粒pKSV7等。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其被所述载体所转化。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属;鼠伤寒沙门菌、李斯特细菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO,COs.293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

其中，特别优选单核细胞增生性李斯特细菌（Listeria monocytogenes，以下简写为LM），如yzuLM4等。