[发明专利]一种人腺病毒检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种人腺病毒检测试剂盒，具体是一种基于荧光PCR的腺病毒检测试剂盒。

背景技术

人腺病毒（(Human adenoviruses，HAdV)属于腺病毒科，是一群分布广泛的DNA病毒，可分为A～F六个亚种，共51个血清型。腺病毒是无包膜病毒，在低pH值环境下可稳定存在，有很强的耐物理和化学试剂的作用的能力，腺病毒可对胃肠分泌物和胆汁产生耐受，因此腺病毒可在胃肠内复制，产生很高的病毒载量。腺病毒常在咽、结膜、肠道及淋巴组织内繁殖，并导致各种各样的临床症状，比如呼吸系统的感染、结膜炎、胃肠炎、肝炎、出血性膀胱炎、神经系统的紊乱等。不同的腺病毒亚种会引起不同的疾病，如人腺病毒C亚种主要引起小儿科的上呼吸道感染，人腺病毒B亚种常在成年人中引起流行，人腺病毒B和E亚种是军营人员感染的主要病因，人腺病毒F亚种会引起感染性腹泻。腺病毒在有免疫力的宿主体内感染是温和的，而且具有自限性。腺病毒可通过人、水、媒介物和器械传播，室温条件下，腺病毒在污物中存在周期可延长至3周。腺病毒在儿童和军营人员中更易发生感染和大规模流行，大多数婴幼儿在出生后的5年内至少感染过1种腺病毒株。在过去的几年中，腺病毒作为主要的病原体在免疫功能低下宿主如艾滋病人、免疫遗传缺陷的患者、骨髓接受者、固体器官和造血干细胞移植者中常引起高发病率和死亡率；儿科经受同种型干细胞移植的病人，其感染腺病毒后死亡率可高达60%。一些致命的感染常由腺病毒血清型1、2、3引起，在这些病人体内常会出现细菌、真菌等微生物共感染的情况。艾滋病人感染腺病毒会产生肺炎、肝炎、脑膜软化、肾炎、胃肠炎等并发症。因此能够及时确诊何种病因致病，做到早发现早治疗，减少病情恶化，故早期诊断极为重要。

对腺病毒的检测依赖于疾病的类型和所获取的标本，确诊腺病毒的存在可采用病毒的细胞培养、抗原测定和基因组检测等技术。尽管细胞培养仍然是HAdV的金标准，但其对临床标本不敏感，且比较慢，易受细菌和真菌的污染。抗原检测常用来直接检测腺病毒在呼吸道和胃肠道的感染，较快速且灵敏度较高。免疫荧光（尤其对呼吸道标本、咽拭子和活组织标本）和酶免疫分析（尤其对于粪便标本）是常用的方法，与细胞培养相比，免疫荧光检测腺病毒的灵敏性能提高40～60%。其它直接测定抗原的方法包括免疫层析法和乳胶凝集法。研究证实，与细胞培养检测方法相比，使用免疫层析试剂盒所测定的灵敏度可达90%。

近年来，聚核酶链式反应(PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势，荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。

PCR技术为人腺病毒的检测提供了又一新的途径。定量PCR的出现，打破PCR只能定性的局面，其中荧光定量PCR以其高灵敏度、高特异性、低污染率、实时监测等特点，可为临床提供更加准确、客观的检测结果，并及时地了解病情及预后。目前国内还没有荧光PCR诊断试剂盒在临床HAdV感染诊断中使用，因此设计开发高灵敏度、高特异性的HAdV核酸荧光PCR诊断试剂盒具有非常重大的意义。

运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。

目前国内临床上主要采用直接煮沸法对痰液、咽拭子等样本中的HAdV核酸进行提取，具体是向经过预处理的样本中加入某种核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板；该方法核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对高浓度的样本裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。