[发明专利]通过弱化5‑氨基乙酰丙酸脱水酶活性获得5‑氨基乙酰丙酸高产菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物发酵技术领域。具体地说，本发明涉及利用5-氨基乙酰丙酸脱水酶活性弱化的细菌提高5-氨基乙酰丙酸产量的方法和应用，以及5-氨基乙酰丙酸脱水酶活性弱化的生产菌株。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-minolevulinic acid，ALA)是生物体合成血红素、叶绿素、VB12等四吡咯化合物的前体，广泛存在于动物、植物和微生物中。ALA在医药和农业领域的应用非常广泛，在医药上ALA可以作为光敏剂用于癌症治疗和肿瘤诊断，在农业上ALA既可以作为植物生长调节剂促进作物生长，又可以作为生物农药用作杀虫剂和除草剂。ALA可以通过化学合成法和生物发酵法制备，而清洁高效的生物发酵法逐步成为研究和开发的重点，并已经得到了产业化应用。

目前ALA的生产菌株主要是通过诱变育种或基因工程改造获得，现有文献报道的基因工程改造的研究大多集中在强化ALA的合成途径上，例如增强ALA合成途径关键酶的表达，而对ALA的下游代谢途径的改造较少。

5-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)是由hemB基因编码，催化两分子ALA缩合形成一分子胆色素原(PBG)，进一步通过多步酶促反应合成终产物血红素等四吡咯化合物。而血红素等下游代谢产物的生成不但降低ALA的积累，对目的产物的分离提取亦造成很大的麻烦。因此，在ALA工程菌株构建及发酵过程中为了避免合成的ALA过多地代谢合成血红素等副产物，对ALAD活性的控制非常关键。但由于四吡咯化合物参与多种基础生命活动，因此hemB基因缺失使得菌体生长受到很大影响，甚至无法生长。为了降低ALA的下游代谢，现有研究中常用的方法是在发酵后期添加乙酰丙酸、D-葡萄糖、D-木糖等抑制剂抑制ALAD的活性，以增强ALA的积累(Nishikawa等,J Biosci Bioeng,1999.87(6):798-804；Liu等,Appl Biochem Biotechnol,2010.160(3):822-830；EP718405； WO9854297；CN101041839)。然而，上述在发酵后期添加ALAD抑制剂的方法不仅造成发酵工艺复杂，生产成本提高，而且不利于后续产物的分离提取，因此，这种外源添加ALAD抑制剂的方法不利于ALA的大规模工业化生产。此外，有报道也曾尝试将胞内合成的ALAD快速降解，但ALAD的降解不但没有引起预期的ALA产量的提高，反而造成其产量的下降(王阳，山东大学硕士毕业论文，2012)。而在基因水平上，Xie等(Xie等,Biotechnol Lett,2003.25(20):1751-1755)研究发现以hemB基因发生突变的CGSC4676菌为宿主菌表达外源ALA合成酶，ALA的产量与野生菌相比没有明显提高；专利EP718405公开了一种用于ALA生产的类球红细菌CR-520，该菌株中ALAD突变降低了抑制剂的添加浓度，虽然该方法提高了ALA的产量，但突变的目的在于增强抑制剂乙酰丙酸的抑制效果，降低乙酰丙酸的添加量，发酵过程仍然没有摆脱对抑制剂添加的依赖。

综上所述，本领域急需开发高产量、低成本、简单的ALA制备方法。

发明内容

本发明的主旨在于提供5-氨基乙酰丙酸高产菌株的构建方法以及5-氨基乙酰丙酸的高产菌株。

在第一方面，本发明提供一种5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建方法，所述方法包括：弱化所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性。

在优选的实施方式中，所述弱化是将5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性降低但不完全丧失。

在另一实施方式中，所述弱化是将所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株中5-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性降低至原始活性的0.5%-50%，优选降低至原始活性的0.5%-30%。

在优选的实施方式中，所述弱化通过以下方法之一或组合实现：部分敲除5-氨基乙酰丙酸脱水酶的编码基因hemB、5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因突变引起氨基酸残基变化、改变5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化、改变5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定等。

在优选的实施方式中，所述弱化通过5-氨基乙酰丙酸脱水酶编码基因突变 实现。

在优选的实施方式中，所述基因突变是通过易错PCR实现。

在优选的实施方式中，所述构建方法是在hemB缺失的菌株中回补催化活性降低的5-氨基乙酰丙酸脱水酶突变基因。