[发明专利]一种拓宽基因工程酶pH作用范围的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶基因pH作用范围的技术，具体是发明了一种拓宽酶基因在酵母中pH作用范围的方法，将酶基因A的上游5’及下游3’端分别插入酶切位点，将酶基因B的上游5’及下游3’端分别插入酶切位点后，分别构建酶基因A、B的克隆载体pUCm-A和pUCm-B。经酶切及测序后构建了融合表达中间载体pPIC9K-B，再经酶切及测序后构建融合表达载体pPIC9K-AB。将重组质粒线性化后，电击转化酵母宿主细胞。经MD和MM平板筛选及酶活性测定，获得融合酵母阳性菌株。

背景技术

酶作为一种生物催化剂， 其在农业中的应用，主要作为催化剂或添加剂使用。在食品方面，主要起催化作用，用于农副产品的深加工。如利用α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等对以淀粉为原料进行生产高果糖浆的工业。纤维素酶、木质素酶等用于纤维素农副产品等物质的分解与利用，保护环境，节约资源。酶工程在饲料工业中的应用已经颇为广泛。随着生活水平的日益提高，人们对绿色食品消费需求逐渐增加，对畜牧业生产与过程中的生态环境保护日益重视，饲用酶制剂以其高效、安全、低成本等特点，成为了世界新型饲料添加剂研究和应用热点。

目前，酶被广泛用于饲料行业的生产，构建了各种基因工程菌并得到了高效表达，并进行了规模化的发酵生产，大大提高酶产量和降低了生产成本，已在饲料工业中被广泛应用。添加一点酶，就可以减少很多污染。然而，在饲料中，有的酶添加剂的酶催反应有效作用pH范围较低，在2.5-5.5之间，主要适用消化道呈酸性的单胃动物，而不适用于肠道呈中性的动物，不能在pH值接近中性的单胃动物肠道中表现酶活性。随着养殖业的发展，饲料使用量越来越大，产生的污染越来越多，因此，需要开发出pH作用范围广，热稳定性强的酶作为添加剂，用于饲料生产，从而减少污染。

现在，随着酶基因工程技术性问题的不断突破，因其先进的技术，低耗能，高效率等特点，还被广泛用于医药卫生、食品加工、能源开发以及环境工程等方面。而对于医药工业、能源开发及环境工程等方面，需要的酶的作用条件更为广泛和特别。因此，可以通过对酶基因进行改造，使其在酵母或者大肠杆菌等受体细胞中表达，从而拓宽酶的作用范围及稳定性等特性，从而使基因工程菌在同等条件下工作效率更高，节约资源和成本。

     此外，酶工程还广泛用于食品添加剂生产，不断开发新酶源，研制新产品，可以降低生产成本，产品易纯化，收率提高。如酶工程在甜味剂、调味剂、抗氧化剂中的应用。采用低浓度的乙醇、氨基酸和溶菌酶复酶添加入食品的杀菌防腐的方法越来越受到人们的重视，并在食品加工业中广泛推广。随着近年来酒精需求量的上升，固定化细胞技术应用于酒精工业生产方面的研究也变得非常活跃。

发明内容

本发明主要解决的问题是拓宽酶作用pH范围，提高酶热稳定，实现改造酶基因在酵母或大肠杆菌等受体细胞中的高效表达，改变酶基因的某些特性，整体上提高酶基因的pH作用范围等问题。获得高效表达酶基因工程菌，从而解决不同产业中的各种问题。

本发明主要通过以下方法步骤实现：

（1）从Genbank中下载酶编码基因序列，获得具有不同pH作用范围的目的酶基因A和酶基因B。

（2）利用分子生物学软件Lasergene 分别分析酶基因A和酶基因B的碱基含量、密码子分布情况、AT组成及GC含量等，并分析酶基因A和酶基因B的密码子在酵母中合适度，选用酵母高频密码子，减少基因中低频密码子，优化设计酶基因A和酶基因B。

（3）得到优化酶基因A和酶基因B，并合成基因，在合成基因上游5’端加入XbaI/NdeI/KasI/SnaBI等酶切位点，下游3’端加入NsiI/NspI/KpnI/NotI等酶切位点，以便基因转入表达载体pPIC9K/pPIC3.5K，获得优化基因重组表达载体pP- A，pP- B。

（4）根据优化基因A、B，设计酶基因A、B基因胞外表达片段的PCR引物2对，在优化基因A上游5’端引入酶切位点，在下游5’端引入酶切位点；在优化基因B上游5’端引入酶切位点及接头(G₄S)₃，在下游5’端引入酶切位点。