[发明专利]纳米模拟酶免疫层析检测方法

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料及生物医学纳米技术领域。本发明涉及磁性纳米颗粒模拟酶，并提供了其应用于免疫层析生物分子检测的方法。

背景技术

胶体金免疫层析法是20世纪90年代初发展起来的以胶体金为标记物的检测方法，它把免疫亲和技术、印渍技术和斑点薄层层析技术组合在一起。由于用该层析条检测的时候，所有样品均经过较窄的纤维素膜的持续性反应，实际上对被测物质起到了浓缩、聚集作用，提高了反应的灵敏度，加快了反应速度，整个操作时间仅需3～15分钟。其原理是将特异的抗体(或抗原)先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动(层析)，当移动至固定有抗体、抗原的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金作标记物可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。传统的胶体金免疫层析技术具有操作简便、经济、快速等特点，但由于灵敏度相对较低，严重制约了其在生物分子检测方面的广泛应用，信号放大是解决免疫层析技术灵敏度低的关键所在。

磁性纳米颗粒具有良好的生物相容性，其既具有纳米材料所特有的性质，如粒径小、比表面积大、偶联容量高，又具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热，利用这些特性，磁性纳米颗粒被广泛应用于磁共振对比剂、磁靶向药物载体、细胞与生物分子分离、生物传感与检测以及磁感应肿瘤热疗等生物学领域。

最近几年，磁性免疫层析(Magnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)作为一种新一代单人份快速定量检测技术逐渐发展起来，它是以超顺磁性纳米颗粒代替传统的标记物(胶体金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，最后通过磁信号阅读仪读取结合在检测线处磁颗粒的磁场强度，从而对所检样品进行定性定量判断。目前国内成型的磁信号阅读仪还没有上市，国际上也只有少数外国公司(如美国MagnaBioSciences公司)具有该项技术，但其价格昂贵，因而限制了磁性免疫层析的发展和推广。

近年来，我们课题组研究发现磁纳米颗粒具有内在的模拟酶活性，可替代过氧化物酶进行免疫检测(阎锡蕴等，Nature Nanotechnology.2007)。最近，我们课题组又研制了三功能(识别、催化、磁性)于一体的新型免疫组化检测试剂，发现磁颗粒表面包裹蛋白分子后仍然具有酶活性(阎锡蕴等，Nature Nanotechnology.2012)。这种催化活性与辣根过氧化物酶相似，在过氧化氢存在下，磁性纳米颗粒可以催化辣根过氧化物酶的底物，如可以催化3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)生成蓝色的产物，催化二氨基联苯胺(DAB)生成棕色沉淀，催化邻苯二胺(OPD)生成橘红色产物，催化活性依赖于pH值、温度和过氧化氢浓度，其催化机理符合乒乓机制。同时还发现磁性纳米颗粒的催化活性随着颗粒粒径的减小而增强，颗粒的粒径越小，其催化活性越高。磁性颗粒的粒径达微米量级后，催化活性降低至接近零值。磁性纳米颗粒的模拟酶活性，相比蛋白制剂的辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)，具有更多的优势：(1)蛋白酶在极端pH和温度下容易变性，同时也容易被蛋白酶降解，而磁性纳米颗粒在极端条件下很稳定；(2)蛋白酶的生产成本很高，而磁性纳米颗粒制备简单、廉价；(3)由于磁性纳米颗粒具有超顺磁性，用磁铁可以回收反复利用；同时基于磁性纳米颗粒的磁可控性，拓展了其作为模拟酶的应用领域。

发明内容