[发明专利]一株降解除草剂2,4-二氯苯氧乙酸的菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株降解除草剂2,4-二氯苯氧乙酸的菌株及其在污染土壤生物修复中的应用。

背景技术

2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D）是一种活性极强的植物生长调节剂，低浓度时可促进植物生长、诱导愈伤组织形成；但高浓度时作为一种苯氧羧酸类除草剂，被广泛用于禾谷类作物（尤其是麦田和玉米田）、牧草及草坪草中阔叶杂草的防除。自20世纪40年代工业化生产以来已被广泛应用了70年，我国农药市场先后有近百个除草剂产品，使用面积前20位的产品占到全国农田化学除草总面积75%左右，2,4-二氯苯氧乙酸即为我国农药市场的主流品种之一，近年来我国对2,4-二氯苯氧乙酸的年均需求量在5000吨以上。但是，2,4-二氯苯氧乙酸大量使用会危害人类健康，其具有致癌性及神经毒性，WHO已经将其定为II级毒性的激素除草剂。该除草剂喷施进入土壤后，尽管半衰期相对较短，长期应用已经造成土壤及地下水的污染，修复除草剂2,4-二氯苯氧乙酸污染土壤迫在眉睫。

微生物降解是2,4-二氯苯氧乙酸在环境中的主要代谢途径。对于2,4-二氯苯氧乙酸污染，国内外进行了大量降解微生物的筛选工作。到目前为止，已经分离出多个具有降解2,4-二氯苯氧乙酸能力的菌株，这些菌株主要存在于生长较快的β-和γ-型变形菌门中，如无色杆菌属（Achromobacter）、产碱菌属（Alcaligenes）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、贪铜菌属（Cupriavidus）、代尔夫特菌属（Delftia）、盐单胞菌属（Halomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、红育菌属（Rhodoferax）、多噬菌属（Variovorax）等。如专利“一种2,4-二氯苯氧乙酸丁酯农药残留降解菌及其生产的菌剂”（CN101402927B）分离了一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）Ld1，可使土壤中2,4-二氯苯氧乙酸丁酯的残留量降低70%以上，但目前还未有Cupriavidus campinensis降解2,4-二氯苯氧乙酸的专利报道。

发明内容

本发明针对现有技术中2,4-二氯苯氧乙酸降解能力不足之处，提供一种降解2,4-二氯苯氧乙酸的细菌菌株，该菌株21天对2,4-二氯苯氧乙酸的降解率达成92%以上，实验表明该菌株可以应用于2,4-二氯苯氧乙酸污染土壤的生物修复。

一株降解除草剂2,4-二氯苯氧乙酸的菌株Cupriavidus campinensis，命名为BJ71，保藏编号为CCTCC M2014006。

上述菌株在被2,4-二氯苯氧乙酸污染的土壤进行修复中的应用。

所述应用为将活化的Cupriavidus campinensis BJ71菌悬液加入到被2,4-二氯苯氧乙酸污染的土壤中，混合均匀，土壤上表面覆上黑膜遮盖，保持土壤温度25-30度。

所述BJ71菌的终浓度为1.0-9.0×10⁷CFU/g土壤，加水使土壤含水率保持在最大持水量的40-75%。

所述活化的（Cupriavidus campinensis）BJ71菌悬液制备方法为：从平板上选取一环菌落接入含有500mg/L2,4-二氯苯氧乙酸的LB液体培养基中，摇瓶装液量为体积的40%、150rpm转速、30℃条件下过夜活化；吸取500μl活化的菌液，转接入相同成分的新鲜LB液体培养基中，相同条件下培养至OD₆₀₀为0.6左右；5000g离心5min收集菌体，用0.85%的生理盐水清洗两次后，悬浮于生理盐水中。

本申请从北京市顺义区木林镇施用除草剂2,4-二氯苯氧乙酸多年的麦田土壤中采集距地表下5～29cm处表层土壤样本，加入到含有2,4-二氯苯氧乙酸的MSM液体培养基中进行富集培养，然后将培养液稀释后涂布在含2,4-二氯苯氧乙酸的MSM固体培养基上30℃恒温培养；将在含2,4-二氯苯氧乙酸为唯一碳源的选择性培养基上长出的单菌落活化后分别接种于含有2,4-二氯苯氧乙酸的MSM液体培养基中，30℃黑暗培养，最终筛选到培养2d时可降解2,4-二氯苯氧乙酸约85%总量的BJ71菌株。菌株保存于含500mg/L2,4-二氯苯氧乙酸的LB培养基中。该菌于2014年1月6日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号CCTCCM2014006。