[发明专利]一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法

权利要求书

1.一种检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）配制含有(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和氘代(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液，对羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析;

（2）用普通健康吸烟人群尿样中(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯浓度远大于(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的特性确定对应构型物质的色谱峰保留时间，采用内标法分别建立(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯和(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；

（3）准确移取尿液样品于试管中，加入(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5内标溶液和醋酸-醋酸钠缓冲溶液，混匀后的尿液上样到活化好的Oasis MCX固相萃取小柱上进行净化，对样品中的羧基进行甲酯化衍生，对醇羟基进行Mosher衍生，然后对衍生化以后的尿液样品进行HPLC-MS-MS检测。

2.根据权利要求1所述的检测尿液中4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的方法，其特征在于该方法具体包括以下步骤：

（1）标准曲线建立：

以无水乙腈为溶剂，配制(±)4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸标准品单标溶液，保留四位有效数字；按同样方式配制(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的单标溶液；以无水乙腈为溶剂配制含有(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5的混合标准溶液；配制(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液;配制三乙基胺的无水乙腈溶液;分别取混合标准溶液于HPLC-MS-MS色谱瓶中,在-20℃氮气氛围中加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应20分钟，在氮气氛围中真空浓缩至干，再加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，然后对衍生化以后的混合标准溶液进行HPLC-MS-MS分析；

外消旋体4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯标准溶液衍生化生成的一对非对映异构体的峰面积为1:1；以HPLC-MS-MS色谱图中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的浓度与(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯-d5的浓度之比为横坐标，以色谱图中(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的定量离子对峰面积与(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯-d5的定量离子对峰面积之比为纵坐标，建立(S)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；以同样方法建立(R)-4-mosher酯基-4-(3-吡啶基)丁酸甲酯的标准溶液工作曲线；

（2）尿液样品处理：

准确移取尿样于试管中，加入(±)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸-d5溶液，再加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，充分混匀待用；将混匀后的尿样上样到已经活化好的混合阳离子树脂固相萃取小柱上进行净化，用去离子水淋洗后抽干、稀盐酸淋洗后抽干、甲醇淋洗后抽干，最后用甲醇：25%氨水混合溶液进行洗脱，在氮气氛围中浓缩至干，加入无水乙醚，在-20℃氮气氛围中加入重氮甲烷的乙醚溶液，震荡拿出至室温反应，在氮气氛围中真空浓缩至干，再分别加入(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酐的无水乙腈溶液和三乙基胺乙腈溶液在室温下反应过夜，待检测；

（3）HPLC-MS-MS检测条件：

液相条件：用C18色谱柱和乙腈-乙酸水溶液对样品进行分离；

质谱条件：用正离子模式进行多反应检测,分析物特征离子对如表1；

表1 分析物特征离子对

（4）实际检测：

使用优化后的液相色谱分离条件，对处理好的尿液样品溶液进行HPLC-MS-MS检测，使用标准溶液工作曲线计算待测尿液样品溶液中的(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸，进而换算得到原始尿液样品中的(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的含量，再计算得到该尿样中(S)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸和(R)-4-羟基-4-(3-吡啶基)丁酸的比值。