[发明专利]一种新型羰基还原酶、其基因及应用有效
申请号: | 201410012867.9 | 申请日: | 2014-01-12 |
公开(公告)号: | CN103695443A | 公开(公告)日: | 2014-04-02 |
发明(设计)人: | 吴中柳;刘艳;裴小琼 | 申请(专利权)人: | 中国科学院成都生物研究所 |
主分类号: | C12N15/53 | 分类号: | C12N15/53;C12N9/02;C12P7/22 |
代理公司: | 成都赛恩斯知识产权代理事务所(普通合伙) 51212 | 代理人: | 高利丹 |
地址: | 610041 四川*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 新型 羰基 还原酶 基因 应用 | ||
技术领域
本发明涉及一种新的基因及其蛋白质产物,具体涉及一种来源于金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)的新型羰基还原酶ChKRED03及其基因,并利用其生物催化生产(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇,属于应用微生物与酶工程领域。
背景技术
两种光学纯的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇都是合成NK-1受体拮抗剂的中间体,其中R构型是Merk公司研发的药物阿瑞匹坦(Aprepitant,商品名“Emend”)的关键手性中间体,而S构型常用于整合到拮抗剂中用于临床评价(Pollard D,et al.Effective synthesis of(S)-3,5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric enzymatic reduction.Tetrahedron:Asymmetry,2006,17,554-559)。近年来,以潜手性酮3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物经生物催化过程获得S构型醇迅速发展。目前报道的可以实现该催化过程的的微生物菌株有Saccharomyces Rhodotorula(张芳等,红酵母静息细胞催化(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的不对称还原反应.药物生物技术,2007,14(6):411-414)、Candida tropicalis104(王普等,一种微生物转化制备(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法.中国专利,CN101519674)等,这些全细胞的生物催化过程往往ee值不高或者底物转化浓度较低;商业酶则有来自Rhodococcus erythropolis、Candida parapsilosis、Candida boidinii等菌株的乙醇脱氢酶ADH,其中由Merk公司开发的ADH RE(来源于Rhodococcus erythropolis)催化工艺(Pollard D,et al.Effective synthesis of(S)-3,5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric enzymatic reduction.Tetrahedron:Asymmetry,2006,17,554-559),已达到100g/l的工业化水平,该过程需要添加甲酸脱氢酶FDH用于辅酶循环。开发更多有潜力的催化剂,既可获得具有自主知识产权的生物催化工艺,又能丰富生物催化工具箱。
发明内容
本发明的目的是公开一种羰基还原酶ChKRED03及其基因,以及利用该酶还原底物3,5-双三氟甲基苯乙酮制备光学纯(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法。
本发明所述的羰基还原酶ChKRED03的基因碱基数为735bp,其序列为SEQ ID No.1,编码244个氨基酸残基,其序列为SEQ ID No.2。
羰基还原酶ChKRED03从金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因组中克隆获得,该菌的保藏编号为CCTCC M2012484(中国武汉,中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2012年11月27日)。
羰基还原酶ChKRED03的基因PCR扩增时设计的引物如下:正向5′-gaattcATGAATTTCACAGATAAAAATGTAATCATTAC-3′(酶切位点EcoR I),反向5′-aagcttTATCTGCGGATCGTTACTCC-3′(酶切位点HindⅢ)。模板为金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因组DNA。获得的目标基因所编码的蛋白质命名为羰基还原酶ChKRED03。将目标基因连入pET28a(+)空载体中,构建重组质粒pET28a-ChKRED03,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌。将上述构建的重组菌以常规方法诱导表达后,经纯化获得纯酶。
根据本领域技术人员所熟知的知识,任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体,转化至合适宿主细胞,经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此,羰基还原酶ChKRED03表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等,表达宿主可以为大肠杆菌,毕赤酵母,链霉菌等。
本发明还提供了羰基还原酶ChKRED03作为生物催化剂在转化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。其反应式如下:
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