[发明专利]一种检测柯萨奇病毒A6、A10型的荧光定量试剂盒

说明书

技术领域

    本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种一步法双重实时荧光定量RT-PCR在同一个反应管内检测患者粪便标本中柯萨奇病毒A6、A10型的核酸检测方法，可应用于柯萨奇病毒A6、A10型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及手足口病的流行病学的研究。 

背景技术

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由人类肠道病毒(human enterovirus， 

HEV)引起的一类儿童常见传染病。人类肠道病毒目前共有90 多种基因型，分为A、B、C、D共4个组，其中最主要的病原体是HEV-A组中的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus A16，CVAl6)。但越来越多的研究表明，HEV中的一些其他血清型，如CVA6、CVA10、CVA2、CVA5型等也可引起HFMD。

柯萨奇病毒A6型(Coxsackie virus A6，CVA6)和柯萨奇病毒A10型(Coxsackie virus A10，CVAl0)均属于人类肠道病毒A组，近年来在欧洲及我国周边部分国家爆发的手足口病疫情中，柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒A10型多次被作为主要致病病原体检出。2008年，芬兰爆发了以柯萨奇病毒A6、A10型为主的手足口病。2010年，法国手足口致病病原调查中，柯萨奇病毒A10和A6型的比例远远超过EV71和柯萨奇病毒A16型。而近年来，一些亚洲国家如新加坡、泰国、日本等也相继爆发了以柯萨奇病毒A6为主的手足口疾病疫情，其中柯萨奇病毒A10型也占了一定的比例。在我国，2009年至2011年在山东、河南、重庆三省市展开的一项手足口病调查显示：柯萨奇病毒A10型和A6型仅次于EV71和柯萨奇病毒A16型，位居第三、四位。2012年，深圳市的手足口病调查中，柯萨奇病毒A6型和A10型仅次于EV71和柯萨奇病毒A16型，位居第三、四位。而在我们实验室开展的2013年部分月份手足口病原调查中，柯萨奇病毒A6型和A10型占到了极高的比例。目前我国的手足口病病原诊断市场，仍然以检测肠道病毒通用型或肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型为主，导致手足口病病原体检测不明确或漏检等，造成患者治疗的延误及诊断试剂的浪费等。因而开发一种针对柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒A10型病原检测的诊断试剂迫在眉睫。 

实时荧光定量PCR技术以其全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。 

发明内容

    本发明的目的是提供一种检测柯萨奇病毒A6、A10型的荧光定量试剂盒，是一种用于柯萨奇病毒A6型和柯萨奇病毒A10型检测的一步法双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品（CVA6、CVA10）、强阳性对照品（CVA6、CVA10）、弱阳性对照品（CVA6、CVA10）、阴性对照品。 

    其中定量RT-PCR反应液包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含CVA6、CVA10两组特异性引物和相应的CVA6、CVA10两种不同荧光标记的特异性探针，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，CVA6、CVA10强阳性对照品和CVA6、CVA10弱阳性对照品为包含CVA6、CVA10的保守区基因序列的阳性质粒样品。引物探针混合液需保存在棕色管。 

    双重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下： 

上游引物CVA6-F: 5’- AARCCRGATAGYAGGAAATC-3’

下游引物CVA6-R：5’- GGGGTGGATCACTCAATTTTG-3’

特异性探针CVA6-P: 5’-FAM- CAATGGCAGACTGCYACYAAYCCGTCG-BHQ1-3’

上游引物CVA10-F: 5’- GAGACTGGACGYGTRCCA-3’

下游引物CVA10-R: 5’- GGGTYTCAATCATGTTYTCATCTG-3’

特异性探针CVA10-P: 5’-HEX- CAGAGACRGGTGCCACWTCTAAYGCC-BHQ1-3’