[发明专利]一种诊断用微小隐孢子虫重组抗原

说明书

技术领域

    本发明属生物学诊断技术领域，确切地说是一种诊断用微小隐孢子虫重组抗原及以该抗原为诊断抗原检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒。

背景技术

隐孢子虫属顶复门原虫。从致病性方面分类该虫属于机会性原虫。虫体主要寄生于胃肠道上皮细胞的微绒毛边缘，感染宿主后症状表现轻重不一。隐孢子虫是公认的引起发展中国家儿童腹泻的重要原因之一也是艾滋病患者，免疫力低下者主要的致死原因。目前为止隐孢子虫分为24种，其中感染人的主要虫种为微小隐孢子虫（C．parvum）和人隐孢子虫（C. hominis）。美国将微小隐孢子虫列为B类生物武器。本病缺乏明显的临床特征，在症状和体征上与其他病原体引起的肠炎相比无明显区别。目前隐孢子虫的检测方法主要包括病原学检测、免疫学检测和分子生物学方法。但是，病原学检测费时、费力，镜检的敏感性差、干扰多。分子生物学方法对仪器要求较高，不宜普及。免疫学检测具有较高的特异性与敏感性适用于临床诊断与流行病学调查。

但是目前国内外的研究的重组抗原主要集中在表面抗原 CP23、CP41、SA35 与SA40等。隐孢子虫很多虫种的基因组信息已经公布，这将为更多抗原，特别是诊断等抗原分子的研究提供重要基础。

国内尚无标准化的重组抗原诊断试剂盒，所以急需寻找新的敏感、特异的重组抗原，对隐孢子虫病流行病学调查和防治研究具有重要意义。因此本实验旨在筛选可替代天然抗原的重组抗原，用于隐孢子虫病的免疫学诊断。

发明内容

本发明的目的是为提高隐孢子虫病的免疫学诊断敏感性和特异性，而提供一种微小隐孢子虫重组抗原基因、重组抗原蛋白及用于隐孢子虫病的免疫学诊断试剂盒。

一种微小隐孢子虫重组抗原基因MUCIN，它的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

一种微小隐孢子虫重组抗原rMUCIN，它是由碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示基因表达的蛋白。

ELISA检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒，它的检测抗原是由碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示基因表达的蛋白；

所述的ELISA检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒，阳性对照为微小隐孢子虫rCp23抗原。

本发明提供了一种微小隐孢子虫重组抗原基因MUCIN，及其表达的融合蛋白重组抗原rMUCIN，随机取的520份健康人血清，用重组抗原rMUCIN和rCp23做检测抗原，ELISA检测人血清IgG抗体，用spss软件对数据进行分析rMUCIN蛋白质与rCP23蛋白质检测未知血清阳性率相同（X_C²=0.370  P=0.543＞0.05），而rMUCIN蛋白质检测未知血清阳性率高于微小隐孢子虫粗抗原（X_C²=5..222  P=0.02＜0.05）。本发明还提供了ELISA检测抗微小隐孢子虫 IgG抗体的试剂盒，它是以重组抗原rMUCIN做检测抗原，以rCp23做阳性对照，特异性、敏感性和可靠性更强。

附图说明

    图1 MUCIN基因1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR的产物图；  M :Marker；1:MUCIN基因的PCR扩增；

图2 克隆载体酶切鉴定结果 ；M :Marker；1:重组质粒 PMD18-T- MUCIN双酶切；

图3重组表达载体的酶切鉴定结果； M :Marker；1:重组质粒pET-28a-MUCIN双酶切；

图4 、5纯化的目的蛋白鉴定结果； M :蛋白质分子量标准；1:重组蛋白质rMUCIN；

图6 重组抗原MUCIN和CP23抗微小隐孢子虫 IgG抗体反应吸光度值的线性回归；实线表示最佳拟合线；

图7  Western blot检测阳性血清样本，M: 蛋白质分子量标准；1-15：重组抗原MUCIN Western blot检测部分阳性血清样本；NC：阴性对照。

具体实施方式

    实施例1微小隐孢子虫抗原基因的MUCIN的克隆

一、提取微小隐孢子虫C．parvum (长春分离株)总DNA 

（1）1×10⁷个微小隐孢子虫加入1ml裂解液((0.5% SDS ,1mM EDTA , 50mM Tris-HCl （pH 8.5）)悬浮沉淀两次，每次14000×g，5min，弃掉上清；