[发明专利]一种基于亲水固相萃取技术的蟾蜍二烯内酯类化合物类分离纯化方法

权利要求书

1.一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离的纯化方法，其特征在于：

1）蟾蜍皮乙醇提取物先经制备型RPLC分离，水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为体积浓度25%→100%B（v/v）；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，每个组分浓缩至干后备用；

2）针对富含蟾蜍二烯内酯的组分F14，分离过程中F14组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为58.3%-59.6%；采用Click XIon亲水固相萃取柱对两类化合物进行类分离，固相萃取条件：亲水固相萃取柱为两性离子固相萃取柱（Click XIon，20g/60mL）；淋洗条件为：淋洗1：95%（v/v）乙腈-水或乙醇-水80mL，回收溶剂得F14-F1；淋洗2：50%（v/v）乙腈-甲酸水或乙醇-甲酸水80mL，（酸水体积浓度为0.1%-0.5%）回收溶剂得F14-F2；

3）针对F14-F1和F14-F2，采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液流动相体系，对蟾蜍二烯内酯类化合物进行选择性地分离。

2.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：固相萃取柱为含两性离子的亲水固相萃取柱（Click XIon），采用台阶等度洗脱方式，对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物进行类分离。

3.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯类分离方法，其特征在于：固相萃取操作参数如下：色谱柱内径为10-1000mm；采用体积浓度85%-100%乙醇-水溶解或体积浓度90%-100%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上样浓度为1mg/mL^-1-1g/mL；上样量为1mL-400mL；流速为5-1000mL/min。

4.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-100mm；采用体积浓度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上样浓度为1mg/mL^-1-1g/mL；进样量为1μL-40mL；流速为1-480mL/min；柱温为10-60℃。

5.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯固相萃取类分离方法，其特征在于：所述洗脱溶剂流动相组成为乙腈-水或乙醇-水体系。

6.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述流动相组成为乙腈-水、甲醇-水、乙醇-水。

7.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述蟾蜍皮提取物为50%-95%（V/V）乙醇回流提取物。

8.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：

1）蟾蜍皮50%-95%（V/V）乙醇提取物先经制备型RPLC分离，色谱条件：色谱柱为碳十八柱（C18TDE柱）；水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为0-7min,体积浓度25%→40%B;7-60min,体积浓度40%→65%B;60-65min,体积浓度65%→100%B;65-75min,100%B；流速为330mL/min；检测波长为300nm；其采用体积浓度65%甲醇-水溶解，样品溶液浓度为440mg/mL，其采用体积浓度65%甲醇-水溶解；进样体积为40mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，共计22个组分，每个组分浓缩至干后备用；针对组分F14(分离过程中F14组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为58.3%-59.6%)，采用含两性离子的Click XIon亲水固相萃取柱台阶等度洗脱方式实现了蟾蜍二烯内酯类化合物的类分离，通过半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈-水流动相体系，采用线性梯度洗脱方式制备蟾蜍二烯内酯单体化合物；

2）选取组分F14采用Click XIon亲水固相萃取柱对两类化合物进行类分离，固相萃取条件：亲水固相萃取柱为两性离子固相萃取柱（Click XIon，20g/60mL）；淋洗条件为：淋洗1：95%（V/V）乙腈-水或95%（V/V）乙醇-水80mL，回收溶剂得F14-F1;淋洗2：50%（v/v）乙腈-甲酸水或乙醇-甲酸水（酸水体积浓度为0.1%-0.5%）80mL，回收溶剂得F14-F2；

3）选取组分F14-F1和F14-F2,采用半制备反相色谱进行进一步分离，色谱条件：色谱柱为半制备反相色谱柱（XCharge C18,250×20mm,i.d.,5μm）；水（A）和乙腈（B）流动相体系；流速为19mL/min；检测波长为300nm；进样次数：3；进样量为2mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1-7七个化合物；

通过反相色谱制备获得两类八个高纯度蟾蜍二烯内酯化合物；所述两类化合物分别为两个氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物：化合物1为沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化合物2为远华蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯，五个非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯：化合物3为远华蟾毒精，化合物4为乙酰华蟾毒精,化合物5为乙酰华蟾毒精，化合物6为蟾蜍它灵，化合物7为蟾蜍灵。