[发明专利]叶酸自组装水溶性稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法

说明书

本专利受到国家自然科学基金面上项目21375095，全国优秀博士学位论文作者专项资助资金FANEDD-201023，天津市应用基础研究计划重点项目12JCZDJC21700，天津市高校“中青年骨干创新人才培养计划”ZX110GG015和天津师范大学“渤海学者”引进人才科研项目5RL098的资助。

技术领域

本发明属于荧光纳米材料制备领域，具体涉及一种叶酸自组装水溶性稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法，并应用于细胞成像。

背景技术

稀土掺杂上转换纳米材料，具有许多有机染料和半导体量子点不具备的优点，包括荧光寿命长而无闪烁、毒性低、荧光量子产率高、自体荧光小、化学稳定性和光稳定性好以及渗透深度大，近些年来引起了科研人员的广泛关注，特别在细胞成像和活体成像上已有很多报道，关于叶酸功能化稀土掺杂上转换纳米材料，大都先用PEI包覆稀土掺杂上转换纳米粒子，然后通过EDC和NHS反应得到，过程复杂，成本高，本片采用叶酸自组装PEI包覆的稀土掺杂上转换纳米材料，利用NH₂-和COOH-的化学键作用将其接上，操作简便，成本低，我们知道，癌症细胞表面比正常细胞多很多叶酸受体，而叶酸与叶酸受体能够特异性识别结合，因此，叶酸受体会与叶酸自组装的上转换纳米粒子特异性的结合，并将粒子转运到细胞内，在980nm激发下，发出荧光，但是正常细胞粒子少，荧光弱，即实现了靶向性识别检测。

    之前，我们公开的专利“水溶性红绿光可调谐的稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法”（专利申请号为201310403495.8，公开号为CN103436263A）采用乙二醇-高纯水体系，合成的粒子尺寸均匀，颜色可调，水溶性好，但是在后期的细胞成像中表现出一定的缺陷，例如溶解性差（最高可达10 mg/mL）、荧光较弱、毒性强并且没有靶向性。在此基础上我们对其进行优化，采用二甘醇-高纯水体系,合成的粒子在水中浓度可达30 mg/mL，毒性略小，进一步进行叶酸自组装之后，由于聚乙烯亚胺连接上了叶酸，故其毒性降低，而且可以识别癌变细胞（对比实验如图8所示），在癌症的早期诊断上有很大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、粒径较小、尺寸均匀、成本低、水溶性和生物相容性好、可以靶向成像的叶酸自组装稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法。

为实现上述目的，本发明公开了一种叶酸自组装稀土掺杂上转换纳米材料的制备方法，按如下的步骤进行：

a）稀土硝化物储备液的制备：将氧化钇Y₂O₃ 4 mmol、氧化镱Yb₂O₃ 0.9 mmol、氧化铒Er₂O₃ 0.1 mmol（Y/Yb/Er=80/18/2），称好质量，放入50 mL小烧杯中，加入10 mL浓硝酸，5 mL高纯水，在通风橱中100 oC，硝化，蒸干，加入约20 mL 高纯水，重新溶解析出的硝酸稀土盐，转入50 mL容量瓶中，定容摇匀，每次取5 mL 储备液进行实验。

   b）聚乙烯亚胺修饰的上转换纳米粒子的制备：称取16 mmol的NaF,放于50 mL烧杯中，加入8 mL二甘醇和2 mL高纯水，0.15gPEI，20oC加热搅拌，用5 mL移液管移取5 mL储备液，滴加到上述溶液中，转入三颈烧瓶中，通氮气，油浴200 oC反应0.5 h。

转入25 mL的反应釜中，200 oC下反应24 h，自然冷却。测pH为8，转入到5 mL的离心管中，10000 rpm，10 oC下离心5 min，倾去上面液体，加入3 mL 95%（w/w）乙醇，超声15 min，继续离心，如此再用3 mL 95%（w/w）的乙醇，3 mL高纯水，洗涤三次，转移到表面皿上，真空50 oC干燥；

c）叶酸自组装上转换纳米粒子的制备：将上一步离心洗涤完的粒子（PEI-UCNPs）直接分散在高纯水中，称取0.1-1.0 g的叶酸(FA)，加入0.01M氢氧化钠(NaOH)使其溶解，振荡15min，按步骤b)离心洗涤干燥，得到叶酸自组装的上转换纳米粒子（FA-UCNPs）。

  本发明进一步公开了制备的叶酸自组装的稀土掺杂的上转换纳米材料在细胞成像上的应用，其方法如下：