[发明专利]重组梅花鹿鹿茸胸腺素β4及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β4及其制备方法和用途。

背景技术

胸腺素（Thymosins）是由胸腺产生的一种淋巴生长因子，1966年Goldstein等首次从小牛胸腺中提取发现，是一类小分子多肽。根据等电点的不同胸腺素可分为α、β、γ三个亚型，其中β族胸腺素其结构高度保守，含有40～44个氨基酸，广泛存在于哺乳动物和其它脊椎动物中。而在大多数哺乳动物中，胸腺素β₄是β族胸腺素的主要存在形式，可占其总含量的70%～80%。近年来，胸腺素β₄的生物学功能倍受人们关注，已有研究表明，胸腺素β₄在促进创伤愈合、组织再生、角膜损伤修复、心肌修复、血管生成、抗细胞凋亡和抗炎等方面起着重要作用。可以说胸腺素β₄具有非常广泛的应用领域。而现阶段，临床应用的胸腺素β₄绝大部分为化学合成产品，不仅原料价格高、工艺复杂、收率较低，而且合成过程中用到很多有毒物质，对环境污染较大。随着现代生物技术的发展，利用基因工程手段生产胸腺素β₄将成为一个新的途径。

梅花鹿鹿茸作为我国传统名贵动物药，具有极高的药用价值，已有2000多年的入药历史。鹿茸与其他哺乳动物的角有着明显的区别，每年都可以循环再生，且具有无可比拟的生长速度，最快时每天可达2cm。其独特的生长过程令许多生物学家对其痴迷，并将其视为理想的研究组织器官再生的生物模型。目前，尚未见制备梅花鹿鹿茸胸腺素β4的相关报道。

发明内容

本发明提供一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄及其制备方法和用途。

一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的制备方法，包括如下步骤：

（1）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄基因的克隆：采用改良的Trizol法提取鹿茸总RNA。设计及合成梅花鹿鹿茸胸腺素β₄特异引物，上游引物为5′—CATGCCATGGCCTCTGACAAGCCCGATAT—3′，下游引物为5′—CCCTCGAGCGACTCGCCTGCTTGCT—3′，通过RT-PCR方法扩增得到胸腺素β4基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，全长为135bp，与载体pMD18-T连接，获得重组载体pMD18-T-Tβ₄，将其转化至E.coli DH5α感受态细胞中，用EcoR I和Sal I双酶切鉴定并进行测序验证；

（2）梅花鹿鹿茸胸腺素β4原核表达载体的构建：用Ncol I和Xhol I将测序正确的重组载体pMD18-T-Tβ₄和表达载体pET-28a分别进行双酶切，连接后转化至E.coli BL21感受态细胞中，双酶切鉴定并进行测序验证；

（3）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的表达和纯化：将构建成功的表达载体pET-28a-Tβ₄转化到宿主菌E.coli BL21中，用IPTG诱导表达，采用镍离子亲和层析进行分离纯化，并用Sephadex G-25凝胶层析除盐，收集除盐后的样品，冷冻干燥即得。

所述的IPTG诱导表达，IPTG诱导浓度为0.5mmol/L，诱导时间为4h。

所述的镍离子亲和层析分离纯化时，结合液为含有500mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.4，洗脱液为含有500mmol/L NaCl、200mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液，pH7.4。

所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄在制备对成骨细胞M3T3或软骨细胞C5.18具有促增殖作用的药物中的应用。

本发明利用基因工程技术首次成功构建了梅花鹿鹿茸胸腺素β₄原核表达载体，并诱导重组蛋白高效表达，纯化后的重组蛋白含量可达0.916mg/mL。经体外活性研究发现，其对成骨细胞M3T3和软骨细胞C5.18有明显的促增殖作用。获取梅花鹿鹿茸胸腺素β₄对鹿茸快速生长机制的研究、鹿茸药材有效成分的研究以及开发高科技含量的鹿茸产品都具有重大意义，且具有广阔的应用前景。