[发明专利]PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法。

背景技术

核酸转染细胞（非编码小RNA、信使RNA、或者质粒）被广泛应用于功能基因组学研究、疫苗研究、转录调控研究、干细胞研究、炎症性疾病治疗研究等方面；用于细胞系或者原代细胞转染的方法可以分为两类：一类是基于病毒的转染方法；另一类是不基于病毒的转染方法。对于不基于病毒的转染方法，电转（Electrophoration）是其中最重要的方法之一（特别是对于悬浮细胞），电转的基本原理是通过电击造成细胞质膜短暂的通透，以便于核酸能够进入细胞。作为电转的升级版，核转（Nucleofection）综合了电击以及细胞特异的溶液，能够保证细胞较理想的转染效率以及细胞活力，特别是对于那些很难转染的细胞。

Kasumi-1细胞系是来自于一位患M2型急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia M2）的日本男孩的外周血，该细胞系在白血病发病机理的研究中被广泛使用。然而，研究人员在Kasumi-1细胞的常规核转实践中发现，用质粒核转总是会诱导更加严重的细胞死亡以及更低的转染效率，质粒核转所导致的高死亡率有可能影响所转染目的基因生物作用的客观准确解读，现有技术中亟需一种可靠的核转Kasumi-1细胞的方法，以便进行涉及Kasumi-1核转的相关功能实验。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法。本发明的方法保证了目的基因核转悬浮动物细胞后，能够较客观的观察感兴趣基因本身对悬浮动物细胞所造成的生物影响，排除了核转质粒后所造成的非特异细胞死亡对基因真实生物作用的掩盖。

本发明涉及一种PCR扩增基因核转悬浮动物细胞的方法，包括如下步骤：

步骤一，以重组目的基因的表达质粒为模板，设计PCR引物；其中，正向PCR引物位于质粒启动子上游，反向PCR引物位于质粒转录终止子下游；

步骤二，以重组目的基因的表达质粒为PCR模板，通过所设计的PCR引物进行PCR扩增；PCR扩增所用的DNA聚合酶为具有校正功能的高保真DNA聚合酶；

步骤三，回收PCR产物，即PaGene，并定量及测定A260/A280、A260/A230比值；A260/A280和A260/A230比值需≥1.8，以保证PaGene具有较高的完整性和纯度；

步骤四，选取PaGene，按照Lonza公司核转试剂盒标准操作程序进行细胞转染，所用PaGene用与对应质粒相同摩尔数的剂量进行核转，进而完成PaGene核转悬浮动物细胞。

优选地，所述目的基因可为任何编码蛋白的基因。

优选地，所述重组目的基因的表达质粒可为非诱导型表达蛋白的质粒。

优选地，所述方法包括如下步骤：

悬浮动物细胞在含有适当比例胎牛血清的悬浮动物细胞培养基中培养，培养环境为37℃、5%CO₂；大肠杆菌（E.coli）工具菌株被用于质粒的保存和扩增；用相应试剂盒抽提质粒；所抽提质粒被用于目的蛋白编码基因的扩增；所扩增基因被命名为PaGene；

所述基因用具有校正功能的DNA聚合酶和其对应PCR引物进行扩增；正向引物位于基因启动子上游，反向引物位于基因转录终止子下游；正反向引物的位置保证目的蛋白编码基因在细胞内能够成功转录和翻译；PaGene用相应试剂盒纯化，进而用于核转悬浮动物细胞；

DNA浓度以及A260/A280和A260/A230，比值皆≥1.8，用相应分光光度计测定，以反应对应核酸的完整性和纯度；PaGene亦通过琼脂糖凝胶电泳进行质控；

取悬浮动物细胞被用于核转；

核转所用溶液及程序采用Lonza公司就对应细胞系的说明书进行或者采用常规核转条件；核转后，细胞被转移至37℃预热的悬浮动物细胞完全培养基中继续培养；

进而完成PCR扩增基因核转悬浮动物细胞；与核转质粒相比，核转PaGene能够显著降低悬浮动物细胞的死亡率；PaGene在保证核转悬浮动物细胞较低死亡率的情况下，转染效率没有显著降低或降低很少。

优选地，所述悬浮动物细胞为Kasumi-1细胞、NB4细胞或THP-1细胞。

优选地，所述PCR扩增基因核转Kasumi-1细胞的方法包括如下步骤：

步骤一，以重组目的基因的表达质粒为模板，设计PCR引物；其中，正向PCR引物位于质粒启动子上游，反向PCR引物位于质粒转录终止子下游；